非洲猪瘟病毒间接elisa抗体检测试剂盒的初步研究

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1、万方数据SichuanAgriCUlturalUniversityDIERTATIONSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementforMASTERDEGREEDevelopmentofIndirectELISAAntibodyTestKitforAfricanswinefevervirusPengBinDirectedbyProf．WangYinYa’an，SichuanChinaJune2014万方数据论文独创性声明删㈣俐㈣瓣j、JO120739本人郑重声明：所呈交的学位论文是在导师指导下进行研究所取得的成果。尽

2、我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生虢％秫＼幽l午年石月¨日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容

3、。研究生签名：导师签名：出肛年名月『f日扣，婶年／月卜日科岬、，，f．J厂彰、沙万方数据中文摘要非洲猪瘟(AfricanSwineFever，ASF)是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种急性传染病，强毒株感染导致死亡率达100％，尚无理想的疫苗问世。该病尚未在我国发生，但随着贸易往来越来越密切，该病对我国的威胁随之加剧，因此建立对应的实验室诊断方法十分必要。本研究利用分子生物学方法表达非洲猪瘟病毒的pK205R蛋白，为建立快速、灵敏、特异性的血清学诊断方法奠定了基础。研究取得以下结果。1、非洲猪瘟病毒K205R基因的扩增根据己发表的K205R基因序列设计引物，以人工化

4、学合成的含K205R基因的质粒为模板，扩增K205R基因，将其插入pMD．18T载体中进行测序，所获序列与己发表的ASFV-K205R(GenBankID：NC001659．1)完全相同。2、非洲猪瘟病毒K205R基因在大肠杆菌中的克隆表达用取llI、Notl将含有K205R基因的重组质粒pMDl8T-K205R和载体pET-32a双酶切后，回收、纯化、连接构建成原核表达质粒，命名为pET32a．K205R。将重组质粒pET32a．K205R转化到大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导其表达pK205R蛋白，运用SDS—PAGE鉴定表明pET32a．K205

5、R在大肠杆菌中高效表达，以可溶的形式存在，表达产物分子量约为44．0KD。制备的兔免血清抗体效价达1：512000。以兔免疫血清进行Westernblotting，检测显示抗血清可与pK205R蛋白发生特异性反应，说明本实验原核表达的pK205R蛋白具有良好的反应原性，可以作为检测ASF特异抗体的抗原。利用重组蛋白所带的6xHis标签，用HisTrapFF层析柱进行蛋白纯化，获得纯度较高的重组蛋白。3、建立ASFV间接ELISA抗体检测方法以纯化的pK205R蛋白为包被抗原，通过对抗原最适包被浓度、血清最适稀释度、抗原包被条件、封闭液种类、酶标二抗最适稀释度、血

6、清最适作用时间、酶标二抗最适作用时间、底物显色时间的优化，确定最适工作条件。结果显示，抗原最适包被浓度6．5p．g／mL、血清最适稀释浓度为1：320、抗原包被条件37℃包被1h后转4℃包被过夜、封闭液选择1％BSA、酶标二抗的最适稀释度为1：4000、血清和酶标二抗最适反应时间均为60rain、底物显色最适时间为万方数据15min。4、非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒组装和质量评价利用建立的间接ELISA抗体检测方法，研制非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，并对试剂盒的特异性、敏感性、重复性、保质期进行研究。结果表明，试剂盒在特异性方面，与标准阳性血清呈阳性反

7、应，而与猪瘟(HC)、猪伪狂犬(PR)、猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)、副猪嗜血杆菌(Hps)、猪大肠杆菌(E．c01i)和猪沙门氏菌(SB)6种疾病的阳性血清均无交叉反应；敏感性方面，当标准阳性血清稀释到1：5120时，检测结果小于临界值，建立的ELISA方法敏感性良好；重复性方面，批内、批间重复实验变异系数均不超过】o％。试剂盒在4℃条件下保存4个月后检测结果基本一致。关键词：非洲猪瘟；pK205R蛋白；抗体；ELISA万方数据AbstractAfricanSwineFever(ASF)isanacuteinfectiousswinediseasecause

8、dbyASFvirus(