猪轮状病毒四川株的分离与鉴定

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1、万方数据SichuanAgriculturalUniversityDISSERTATIONSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementforMASTERDEGREEIsolationandidentificationofporcinerotavirusSichuanstrainByCuitingtingDirectedbyProf．WenXintianProf．CaoSanjieProf．HuangxiaoboYa’anSichuanMay2014万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工

2、作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：礁持娉Ⅵ他年‘月胁日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全

3、部或部分内容。研究生签名：崔娉蝽导师签名：文v闭划饵占月乜日杪l归钿l姐万方数据摘要猪轮状病毒(PorcineRotavirus，PoRV)是全球养猪业引起仔猪腹泻的主要病原之一，给养猪业造成较大的经济损失。我国断奶仔猪PoRV感染也较普遍，因此开展该病的病原分离等防控技术研究具有重要意义。本研究对2012年四川成都某猪场的疑似PoRV感染的腹泻病料进行RT．PCR检测，再进行了病原分离，成功分离获得一株轮状病毒，并对该病毒的病毒特性进行了研究。1．病毒的分离鉴定与特性将RT-PCR检测阳性的腹泻病料处理后接种到MAl04细胞中，接毒中采用胰蛋白酶处理活化病毒的方法，60u

4、g／ml胰酶敏化病毒液，并在维持液中使胰酶终浓度为6ug／ml。接毒后第一代便开始出现CPE，但不典型，到第三代时接毒第2天便开始出现CPE现象，出现死细胞，并且死细胞堆积到一块；第3天出现明显的病变特征，表现为细胞界限不清、圆缩、堆积呈菜花状，细胞开始脱落形成空泡区，直至第4天，大量的细胞死亡并脱落。将细胞分离病毒液连续传至22代，每隔3代进行PCR鉴定，结果扩增出预期大小的条带，表明分离出的病毒为PoRV，将其命名为SC．C。测定其TCID50表明病毒以10。。57倍稀释后50ul接种细胞后可导致半数细胞死亡。理化性质鉴定表明，该分离毒株对乙醚和氯仿均不敏感，但将其置5

5、6"C水浴30rain可将其灭活，证明其不耐热。2．VP7基因的克隆、测序与分析本研究根据GenBank中猪轮状病毒VP7全基因序列，设计一对特异引物，对分离株的VP7进行了全基因克隆测序与序列分析。结果表明VP7基因全长1061bp，编码326个氨基酸，核苷酸序列与推导的氨基酸序列长度与其它PoRV的VP7基因相同。将VP7序列同52株韩国分离的猪轮状病毒毒株比较，核苷酸序列和氨基酸序列同源性都在99％以上，表明PoRV的VP7序列相对较保守。将其同其它9株G5血清型毒株进行比对，核苷酸序列同源性为87．4％～99．8％，氨基酸序列同源性也高达92．6％～99．7％，而同

6、其他血清型的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均较低，由此可推断出，该分离株属于G5血清型。利用生物信息学软件VP7蛋白进行分析，其相对分子量为37．018KD，等电点为4．86，不稳定性系数为35．81，具有较强的稳定性，脂溶指数为95．06，总平均亲水性为0．072。该蛋白最大疏水指数为3．678，最小疏水指数为．2．400。1万方数据预测VP7蛋白含有9个抗原位点，4．23位和32．54位存在2个跨膜区，推测此结构与VP7蛋白作为轮状病毒的主要中和抗原相关。PredicProtein预测该VP7蛋白二级结构中c【．螺旋占30．67％，13-折叠占32．52％，8．转角占36

7、．81％，其功能位点中包含1个N．糖基化位点，4个蛋白激酶C磷酸化作用位点，3个酪蛋白激酶II磷酸化作用位点，1个酪氨酸激酶磷酸化作用位点和3个N．豆蔻酰化位点。系统进化分析表明VP7基因同国内东北分离到的一株A组猪轮状病毒(JL94)亲缘性最近，其次与牛源A组轮状病毒具有较近进化距离。3．病毒回归试验取3．75x106PFU／m1细胞分离PoRV病毒液感染4日龄乳猪进行动物回归试验，人工感染乳猪表现为感染3h后四处走动、步态不稳、拱背腹痛症状、呼吸急促，频率为70次／rain，到第5天出现腹泻症状，呈黄色水样腹泻