甘草甜素在铜绿假单胞菌性角膜炎中的治疗作用.pdf

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1、分类号：R772.21密级：公开学校代码：11065学号：2015010039学术博士学位论文甘草甜素在铜绿假单胞菌性角膜炎中的治疗作用作者姓名彭旭东指导教师赵桂秋教授学科眼科学培养单位医学部临床医学系答辩日期2018年5月16日甘草甜素在铜绿假单胞菌性角膜炎中的治疗作用中文摘要目的：探讨甘草甜素（glycyrrhizin，GLY）分别对临床分离的非耐药性，耐药性和多重耐药性铜绿假单胞菌的抑菌特性，及其在不同类型铜绿假单胞菌感染所致角膜炎中的抗炎效果以及对抗生素治疗多重耐药性铜绿假单胞菌性角膜炎的协同作用。方法：本实验是基于3种不同类型铜绿假

2、单胞菌开展的研究，据此，本文分成三个部分进行探讨：1.使用聚合酶链式反应（PCR）测定III型分泌系统的毒力基因。体外实验部分：GLY的最小抑菌浓度（MIC），药物浓度时间作用曲线，细菌活力实验，生物膜形成和粘附实验共同测定GLY的体外抗菌作用。动物模型实验部分：在C57BL/6（B6）小鼠被G81007感染后，用GLY局部滴眼治疗B6小鼠。使用临床评分，裂隙灯下角膜混浊程度和RT-PCR测定的促炎分子基因水平的表达来评估治疗效果。2.使用HARDYISKTM药敏试验测耐药菌株RS1及其他9种临床分离株对抗生素的敏感性。使用电泳PCR测定II

3、I型分泌系统的毒力基因。体外实验部分：GLY最小抑菌浓度（MIC），药物浓度时间作用曲线，细菌活力实验，生物膜形成和粘附实验共同测定GLY的体外抗菌作用。使用质谱蛋白质组学分析测定非耐药菌PAO1和耐药菌RS1的区别，RT-PCR检测了两者RND外排泵系统相关通道分子基因水平的表达差异。动物模型实验部分：用GLY处理RS1感染后的B6小鼠。用临床评分，裂隙灯照相，髓过氧化物酶（MPO）测定，活菌平板计数，RT-PCR和酶联免疫吸附测定（ELISA）评估治疗效果。3.体外实验：测定了GLY单独作用于多重耐药菌MDR9的最小抑菌浓度（MIC），细

4、菌活力实验，生物膜形成和粘附实验，以及GLY联用抗生素环丙沙星（Cipro）和美罗培南（Mero）针对MDR9的抗菌/抑菌能力。动物模型试验部分：用MDR9感染B6小鼠后，使用PBS，GLY和Cipro+/-GLY不同治疗处理组后的临床评分，裂隙灯下的角膜混浊程度和平板计数评估治疗效果。结果：1.三种非耐药性菌株均表达exoS和exoT，但均不表达exoU。MIC均为40mg/mLGLY，并且使用药物浓度时间作用曲线确定G81007的最强效的抑菌浓度和时间为1.5×MIC和3小时。从存活率测试来看，GLY处理组显著增加了细菌的死亡率。与R59

5、733和PAO1（对照）相比，菌株070490和G81007形成相对较多的生物膜。但GLY处理后所有菌株的生物膜形成能力均降低。GLY降低了G81007分离菌株对肺泡上皮细胞和人角膜上皮细胞的粘附性，通过RT-PCR分析发现特定生物膜形成的相关系统调控基因表达也受到GLY的影响。感染G81007后，GLY的治疗降低了角膜炎的严重程度、I裂隙灯下混浊度和IL-1β，TNF-α，CXCL2和HMGB1的mRNA水平表达。2.在耐药性菌株RS1中观察到三种毒力基因（exoS，T和U）均扩增。GLY对RS1的MIC为40mg/mL并且对RS1具有抑菌

6、作用。蛋白质组学揭示了RS1和PAO1（对照）之间的显著差异，同时监测到耐药菌RS1与正常菌株PAO1相比，外膜，外排泵和菌毛蛋白的基因表达显著增加。相比于非耐药株PAO1，耐药株外排抗生素的主要质子泵基因水平表达明显升高。此外，GLY处理组也明显降低RS1生物膜形成能力，及对培养小鼠角膜上皮（CMCE）和人角膜上皮转化（HCET）细胞的粘附能力。在RS1感染的小鼠角膜炎模型中，GLY与PBS处理RS1感染的角膜相比，表现出较低的临床评分，减轻的角膜混浊度，降低的嗜中性粒细胞浸润和细菌负荷。GLY处理还降低了白细胞介素-1β（IL-1β），趋

7、化因子CXCL2的mRNA和蛋白质水平表达，HMGB1和其他炎症因子基因水平也表达降低。3.GLY单纯处理组显著增加了MDR9的死亡率，生物膜形成能力，以及对培养的小鼠CMCE和HCET细胞的粘附能力。GLY（20mg/mL）联用Cipro或Mero的抑菌浓度分别是16μg/mL和2μg/mL。在感染MDR9的B6小鼠的角膜炎模型中，GLY联用Cipro与单独Cipro处理组相比治疗作用明显增强，同时显著降低了角膜活菌载量。结论：1.GLY对眼表来源的非耐药性铜绿假单胞菌具有抑菌作用，且可减弱他们的生物膜形成，降低对上皮细胞的粘附能力和改善角

8、膜病变程度。2.耐药株与非耐药株的蛋白含量和种类差异显著。GLY对耐药性菌株RS1具有抑菌作用，可降低其存活率，生物膜形成和对角膜上皮细胞的粘附能力，并且通过减少促