农杆菌介导的人血清白蛋白基因在小立碗藓中的转化及表达研究

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1、学校代码：10270分类号：Q78学号：152200901硕士学位论文农杆菌介导的人血清白蛋白基因在小立碗藓中的转化及表达研究学院：生命与环境科学学院专业：生物化学与分子生物学研究方向：植物生物反应器研究生姓名：朱彦满指导教师：姚泉洪完成日期：2018年4月上海师范大学硕士学位论文摘要农杆菌介导的人血清白蛋白基因在小立碗藓中的转化及表达研究摘要人血清白蛋白（HSA）是人血浆中的蛋白质，其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸，分子量为66kD。在临床上HSA可用于治疗休克与烧伤，用于补充因手术、意外事故或大出血所致的

2、血液丢失，也可以作为血浆增容剂。在临床和生物技术中具有重要作用，存在巨大的市场需求，单纯靠人血液提取HSA是难以满足市场需求的。而且人血来源容易导致各种污染以及疾病的传播。为摆脱血浆来源有限的产能限制以及解决利用血浆来源的市售HSA存在传染病毒等的风险，利用植物生产抗体等药用蛋白或治疗性蛋白是植物生物反应器的一个重要应用领域。小立碗藓（Physcomitrellapatens）在生物技术中用作重组治疗性蛋白质和具有商业价值的天然产物的异源表达宿主具有很大的优势。因其生活史周期短，易于培养，转基因植株易于分析。而且，

3、小立碗藓是陆生植物中基因重组率最高的植物，有“绿色酵母”之称。其核基因组易于与有同源片段的外源DNA发生高频率的同源重组，小立碗藓以单倍体的形式克隆生长使得其遗传变异水平相对较低。这些优势有利于遗传转化及基因操作后的筛选。小立碗藓全基因组测序已完成，这使得其生物信息学研究及功能基因组对比可以进行。所以选取小立碗藓作为生物反应器生产重组HSA（rHSA）。利用根癌农杆菌介导法将外源基因转入小立碗藓的实例在国内外还没有被报道。具体研究内容和结果如下：1、将pYB1906载体进行改造，利用PTDS基因合成方法人工合成了r

4、HSA基因并连接入pYB1906载体构建了新的植物载体pYB2924，该载体在HSA基因的5’端引入了小立碗藓MTH1蛋白分泌信号肽序列，便于实现在小立碗藓中的分泌表达。2、利用农杆菌介导小立碗藓转化体系，通过农杆菌侵染原生质体的方法将pYB2924基因导入小立碗藓中，得到了具有潮霉素（HYG）抗性的阳性小立碗藓转化植株。并且成功培养出能够分泌rHSA的稳定转化株，建立了成熟的农杆菌介导体系。3、将筛选出的阳性转基因植株经过PCR扩增以及RT-PCR检测证实pYB2924基因已整合入小立碗藓的基因组并在转录水平得到

5、了表达，利用I摘要上海师范大学硕士学位论文SDS-PAGE蛋白电泳证实了该蛋白的表达，最后用ELISA检测证明在小立碗藓中分泌出了rHSA，根据ELISA测定结果，其表达量为27mg/L。关键词：rHSA；Physcomitrellapatens；PTDS法；Agrobacterium；ELISAIIShanghaiNormalUniversityMasterofPhilosopyAbstractAbstractHumanserumalbumin(HSA)isaproteininhumanplasma,andits

6、non-glycosylatedsingle-chainpolypeptidecontains585aminoacidswithamolecularweightof66kD.Clinically,HSAcanbeusedtotreatshockandburns.Itcanbeusedtosupplementbloodlosscausedbysurgery,accidents,ormajorbleeding.Itcanalsobeusedasaplasmacompatibilizer.Itplaysanimporta

7、ntroleinclinicalandbiotechnology,andthereisahugemarketdemand.SimplyextractingHSAfromhumanbloodisdifficulttomeetthemarketdemand.Moreover,humanbloodsourcescaneasilyleadtovariouspollutionsandthespreadofdiseases.Inordertogetridofthelimitedproductioncapacityofplasm

8、asourcesandtoaddresstheriskofvirustransmissionusingcommerciallyavailableHSA,itisanimportantapplicationfieldforplantbioreactorstouseplantstoproducepharmaceuticalproteinssuchasantibo