犬冠状病毒s糖蛋白基因重组犬2型腺病毒的构建及其免疫原性研究

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1、!"卷!期微生物学报&’()!"/’)!#$$"年%月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$*+,+-.#$$"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!犬冠状病毒!糖蛋白基因重组犬"型腺病毒的构建及其免疫原性研究1，01"1#1乔军夏咸柱杨松涛胡桂学谢之景（1中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所长春10$$6#）（#吉林农业大学动物科技学院长春10$11%）（0塔里木大学动物科技学院阿拉尔%!00$$）

2、摘要：首次构建了能表达犬冠状病毒纤突糖蛋白（GG&H1）的重组犬#型腺病毒（G*&7#）。用I47JGI方法从GG&KLM&株细胞培养物中扩增出编码H糖蛋白*、N、G和K!个抗原位点的基因片段H1，将其克隆到O&*L1中，然后将含有GG&H1基因的完整表达盒（GM&7H17J’(A*）进一步定向克隆到含有G*&7#90区的穿梭质粒O&*L90中，构建出O&*L#90H1。通过!"#!P$%&!双酶切O&*L#90H1回收含有目的基因的表达盒，将其克隆入含有G*&7#全基因组的骨架质粒OJ’(A#7G*

3、&7#中，获得重组质粒OG*&7#7GG&7H1。’#"!P()*!酶切OG*&7#7GG&7H1释放重组基因组，转染MKGQ细胞，获得了重组病毒G*&7#7H1。该重组病毒在MKGQ细胞上能产生典型的腺病毒细胞病变。通过:I/*水平和R5-.5SCT(’.检测，证实重组病毒能表达GG&H1蛋白。动物免疫试验表明，该重组病毒可以有效地诱导免疫犬产生抗GG&和G*&7#抗体。关键词：犬冠状病毒，纤突糖蛋白，重组犬#型腺病毒中图分类号：H%"文献标识码：*文章编号：$$$176#$3（#$$"）$!7$"

4、%%7$"犬冠状病毒（’"+,+-*.%.+"/,%&)，GG&）属于冠状（KLM&）由本室分离、鉴定和保存。MKGQ细胞、大病毒科冠状病毒属的单链正股I/*病毒，是引起犬肠杆菌（4)*5-%,*5,"*.#,）WM1$3菌株、质粒O&*L1由［1］急性胃肠炎的重要病原之一。此病毒既能单独致本室保存。含有G*&7#90区的质粒O&*L90和含病，也能与其它病原混合感染，对我国养犬业和野生有G*&7#全基因组的OJ’(A#7G*&7#质粒由本室构［#］动物保护业危害较重。血清学调查结果显示，该建。［0］

5、病呈世界性分布。疫苗接种是控制此病的有效手#$#$"主要试剂：4!K/*连接酶、OX9M74和*M&4M段之一。目前使用的GG&疫苗主要有灭活疫苗和I5Y5S-54S;C-BS

6、犬抗GG&多克隆抗体由本苗是GG&研究的热点。GG&含有!种结构蛋白，其室制备；辣根过氧化物酶标记的兔抗犬Z,X抗体购中纤突糖蛋白（H）是诱导机体产生中和抗体的主要自H<,:;公司。［"U8］保护性抗原，而其主要抗原位点均位于该蛋白#$"犬冠状病毒大熊猫株!#基因的克隆及重组质的前1V#序列中（H1蛋白）。在本研究中，我们运用粒%&’(!#的构建犬#型腺病毒（’"+,+-"0-+./,%&)123-#，G*&7#）基因根据X5CN;C[中GG&KLM&株H全基因序列［8］组为载体，首次构建了能表达GG

7、&H1蛋白且能有效（X5CN;C[登录号：*!06608），设计合成一对引物诱导机体产生抗GG&中和抗体的重组G*&7#病毒。J1和J#，J1："]7*GXX*4GG*G**4XX44**4X4X*G*G**70]；J#："]7G**G4GX*X4G*XXG*GG**G*XX#材料和方法*44G**70]。引物"]端分别含有8"9^!和:5.!#$#材料位点。从KLM&株细胞培养物中提取总I/*，按常#$#$#病毒、细胞和质粒：犬冠状病毒大熊猫株规方法进行I4反应。JGI反应体系（"$"_）：1$‘

8、基金项目：国家自然科学基金资助项目（0$$$$1#0）；全军“十五”医药卫生重点项目（2#$$1$3"）"通讯作者。45(：%67!01763%68!%；97:;<(：=<;7=>?@A;?’’)B’:)BC作者简介：乔军（1381D），男，新疆阿拉尔市人，博士研究生，副教授，主要从事分子病毒学研究。97:;<(：EF81$6#"@A;?’’)B’:)BC其他作者：闫芳1，高玉伟1，黄耕1收稿日期：#$$!71$71%，修回日期：#$$"7$"711&9