抗鸡β2微球蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用

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1、抗鸡B2微球蛋白单克隆抗体的制备及其初．步应用DevelopmentandPreliminaryApplicationofMonoclonalAntibodiesagainstChickenD2·microglobulin硕士生：刘秋导师：秦爱建教授专业：预防兽医学资助项目：国家自然基金项目(31072135，31272560)教育部创新团队项目(IRT0978)江苏省优势学科和江苏省教育厅重大基础研究项目(12KJA23001)扬州大学2013年4月刘秋抗鸡6z微球蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用抗鸡B2微球蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用111111III

2、IInIIIIIIIIIIIIIIIIfY2418956摘要p2微球蛋白(p2-microglobulin，p2．M)是由99个氨基酸残基组成的小分子量(12kDa)非糖基化蛋白质，所有有核细胞均能合成D2．M并与MHC．I类分子形成复合物，成为MHC．I类分子的B链(轻链)，对于维持MHC．I类分子的空间结构和执行正常的生理功能是必须的。除了在机体免疫应答中的生物功能外，p2．M可能广泛参与淋巴癌、前列腺癌、肾癌、多发性骨髓瘤等多种肿瘤细胞的增殖与扩散，并且血清中的B2．M水平与肿瘤负荷有关，是恶性肿瘤的非特异性肿瘤标志物。马立克氏病(Marek’SDise

3、ase，MD)是由马立克氏病病毒(Marek’SDiseaseVirus，MDV)引起的～种鸡的恶性淋巴肿瘤性疾病，以外周神经损害和各种组织器官(法氏囊除外)的弥漫性淋巴瘤为特征。MD是动物癌症中第一个能应用疫苗进行预防的疾病，也是研究人类肿瘤疾病特别是病毒引起的淋巴性肿瘤非常有价值的生物模型。因此，本研究通过制备抗鸡p2．M单克隆抗体，以MD为生物模型，研究血清中p2．M在MD发病不同阶段的含量变化，探讨p2．M与MD淋巴瘤发生发展的关系。1．抗鸡p2微球蛋白单克隆抗体的制备与特性鉴定选取人工合成的鸡B2．M优势抗原表位肽段TF．29作为免疫原免疫BALB／

4、c小鼠，利用杂交瘤技术筛选出特异性强的抗鸡B2一M杂交瘤细胞株5株，分别命名为chl32．M-1E2、ch[32-M-2E9、chp2-M-3D1、chp2-M·6E7、chl32-M-7D5，其中ch[32．M．3D1和chp2．M．6E7亚类鉴定为IgGl／1(链，其余为IgM&链；单抗与TF-29和His．B2．M融合蛋白均具有良好的反应性，间接ELISA测定chp2．M-3D1、chB2．M．6E7腹水效价分别为1：25600和1：204800。应用westernblot、间接免疫荧光鉴定单抗的特异性发现chl32．M．3D1不仅能够与原核表达和真核细

5、胞表达的p2．M特异性结合，还能够与禽类巨噬细胞系HDll中天然的p2一M特异性反应，同时单抗也能特异性识别鸡血清与血浆中游离的B2一M。抗体交叉性试验表明单抗可以特异性识别鸡血清中的B2．M，而与鸭、鹅等禽类以及牛等哺乳动物血清扬州大学硕士学位论文中的p2．M无交叉性。以上结果证实，本研究成功制备了抗鸡B2一M单克隆抗体，其效价稳定并具有良好的特异性，可为深入探索鸡B2．M在MD致病过程中的功能研究提供有力的工具。2．血清中p2微球蛋白在马立克氏病发病过程中的含量变化为探讨血清中D2．M在MD发病过程中的含量变化，本研究首先建立了MD动物模型，将80只一日龄

6、SPF鸡随机分成两组，攻毒组雏鸡腹腔注射感染MDV超强毒株RBlB．CEF0．2mL(病毒量1000PFU)，对照组雏鸡腹腔注射等体积的DMEM基础培养基。在感染后4天、7天、14天、21天、28天、35天、42天分别收集攻毒组和对照组样本，每组随机扑杀4只鸡，采血分离血清，采集胸腺、脾脏、法氏囊、皮肤等脏器冻存于．70℃备用。实验结果发现SPF雏鸡在感染MDV7天时可从外周血淋巴细胞中分离到病毒，应用PCR可从分离的病毒中扩增出RBlB病毒基因Meq(约1020bp)；2～3周后攻毒鸡陆续出现精神沉郁，羽毛蓬乱、劈叉等临床症状；剖检可见病鸡-N坐骨神经、脾脏

7、肿大，胸腺、法氏囊萎缩；4～5周后开始出现皮肤肿瘤，并陆续有鸡死亡。组织病理切片显示，在MDV感染后期胸腺、法氏囊严重萎缩，淋巴细胞大量坏死，结构消失。这些结果表明，SPF雏鸡已成功感染MDV，并发展为MD，成功建立了MD动物模型。然后本研究采用westernblot方法检测了MD发病不同阶段4DPI、14DPI、28DPI、42DPI攻毒组和对照组鸡血清中B2．M的含量变化，同时应用免疫组织化学方法检测了42DPI攻毒组鸡胸腺和法氏囊细胞中B2．M的表达水平。免疫组化结果显示D2．M在42DPI攻毒组鸡胸腺和法氏囊细胞中呈现高表达；westernblot结果

8、显示，与正常对照组相比较，攻毒组鸡在4