細胞毒殺試驗sop20120904-簡體版

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1、一、目的(Purpose)：建立癌细胞毒杀活性分析的方法与流程二、方法(Method)：将血液以Ficoll进行离心分离后，将人类外围口血球(PBMC)与K562细胞共同培养，透过被破坏细胞所释放出的LDH(lactatedehydrogenase),评估PBMC对于K562细胞的毒杀能力评估。三、材料(Material)1・实验所需仪器1.1.无菌操作台(Laminarflow)12分光亮度计(InfiniteM200,TECAN)1.3.37°C细胞培养箱1415ml离心管1.5.96孔U型细胞培养盘1.6.Ficoll-Paquepremium1.7.96孔Immunoplate1.

2、8.悬臂式离心机1.9.75T细胞培养皿及25T细胞培养皿1.10.3ml无菌抛弃式塑料滴管1.11.20〜200⑴微量分注器及10〜1000)11微量分注器1.12.已灭菌200pltip及已灭菌1000

3、11tip1.13.95%酒精及酒精灯1.14.1.5mleppendorf及棕色eppendrof1.15.50孔15ml离心管架1.16.细胞计数器1.17.0.22gm过滤杯1.1&水浴槽2•实验所需试剂2.1.CytoTox96®Non-RadioactiveCytotoxicityAssay(PromegaCat.No.G1780)2.2.RPMI-1640medium(Gi

4、bcoCat.No22400-071)2.3.FBS(胎牛血清)(GibcoCat.No.10091-148)2.4.PSN(Penicillin-Streptomycin-Neomycin(PSN)AntibioticMixture,GibcoCat.No.15640-055)2.5.10XPBSbuffer或IXPBSbuffer2.6.TrypanBlueSolution(FlukaCat.No.93595,0.4%formicroscopy)2•试剂配制3丄配制lxPBSbuffer3.1.1•在1000ml量筒量取100mlI0XPBSbuffer,再加入RO水至量筒刻度1000

5、ml的位置。3.12混合均匀后，倒入1L的血清瓶中，旋上盖子后微旋松，贴上灭菌带，进行121°C、20分钟高压灭菌。3.1.3.灭菌完成后取出，将盖子旋紧，置于室温备用。3.1.4.进行实验操作吋取用需于无菌操作台内操作。32配制1L的70%酒精3.2.1.一般实验室可购买为95%酒精：95%xVl=70%xl0/.V1=7.37L（公升）322.依据上述估算结果，量取95%酒精7.37L（即7370ml的酒精）；323.加入2.63L（10—7.37二2.63）的R.O.水，混合均匀即可。3.3.LDHSubstrateMix试剂配制方法（不需丁-无菌操作台内操作）3.3.1.将・20°

6、C的CytoTox96®Non-RadioactiveCytotoxicityAssaykit中的LDHassaybuffer置于室温屮回温溶解。3.32将LDHassaybuffer平均分装于5管15ml离心管，每管12ml。3.3.3.用铝箔纸包裹15ml离心管避光，置于・20°C保存备用。3.3.4.配制时，从・20°C取岀分装好的LDHassaybuffer（12ml）置于室温中回溶。3.3.5.待LDHassaybuffer完全变成液体后，将buffer加入从・20°C拿击来的substratemixpowder屮（盖子可能沾有粉末，因此开盖时请小心）。3.3.6.混合均匀后，分

7、装到1.5mleppendorf中（建议以棕色eppendrof分装），放冋・20°C保存使用，过程中请避光操作。3・4•配制含10%FBS之RPMI-1640medium（需要在无菌操作台中进行，确保无菌状态）3.4.1.^FBS^-20°C冰箱中取出，于室温或是37°C水浴解冻后，以56°C、30分钟水浴去补体,再分装到50ml离心管中。为避免爆管污染的情形发生，每管约分装45ml的FBS,以parafilm封好管口,再放到・20°C中冰冻保存备用。3.42将100XL-glutamine^-20°C冰箱中取岀，在37°C水浴中解冻并至底部白色粉末完全溶解，再分装到15ml离心管中。为

8、避免爆管污染的情形发生，每管约分装12011的100乂L-glutamine,以parafilm封好管口,再放到・20°C中冰冻保存备用。3.4.3.将100XPSN从・20°C冰箱屮取出，于4°C冰箱屮解冻后，直接分装到15ml离心管中。为避免爆管污染的情形发生，每管约分装12ml的100XPSN,以parafilm封好管口，再放到・20°C中冰冻保存备用。3.4.3.配制1L含10%FBS之RPMI-1640medi