岗梅转录组及三萜皂苷生物合成相关酶基因的挖掘

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1、广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名挑E1期：2014年5月12日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。

2、本人授权广州中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名辍论文导师签名。日期：2014年5月12日羹喜萎嚣}杀喜萎麦授，徐晖研究员巡艘指导老师：陈蔚文教授，徐晖研究员燃岌哆35bl摘要合物，它们因具有显著的生物活性而成为药物开发的目标。然而，由于三萜皂苷的化学结构复杂，提取分离难度大，进而妨碍了对其开发利用。三萜皂苷的生物合成相关岗梅是岭南地区常用的中药材之一，来源于冬青科植物秤星树Ilexaspr

3、ella因，并对部分候选基因进行克隆和功能分析，为进一步阐明三萜皂苷生物合成的机制，在岗梅根转录组数据中，有272条unigenes(约1．30％)被注释为参与萜类的生物合成息息相关的5条代谢通路中。进一步，本研究进行了基于已鉴定基因的同源性比对来深入发掘可能参与三萜皂苷的生物合成途径的候选基因。结果共获得了97条候选unigenes。其中上游途径包括：22条可能参与MVA途径、23条可能参与MEP途径和26条可能编码中间体(如DMAPP、GPP、GGPP和FPP等)合成酶的候选unigenes：下游途径包括：可能编

4、码环氧角鲨烯合成酶(OSCs)、细胞色素P450单加氧酶(CYP450s)和糖基转移酶(UGTs)的unigenes分别有9条、11条和6条。利用MEGA软件对三萜皂苷生物合成途径中的几个关键酶的候选基因做进化树分析，建立了这些候选基因与其他物种同源基因的亲缘关系和进化关系。这些候选基因可用于后续的功能分析和蛋白表达分析。‘3三萜皂苷生物合成途径下游基因的表达水平分析针对转录组数据中筛选出来的岗梅三萜皂苷生物合成下游途径6个关键环节的候选unigenes，以a．mbulin为内参基因，利用实时荧光定量PCR检测各un

5、igenes在岗梅不同组织部位(根皮、根木质部、茎皮、茎木质部、嫩叶、成熟叶、须根和枝)的表达水平。实验结果表明，IaFPPS2187、IASS6896和IaSM3649在各组织部位中均有明显表达，表达量与内参基因相近；3个OSC中，Ia0SC3079的表达量在所有目的基因中最高，而其他两个则表达量极低：2个CYP450s和2个UGTs也都有较低的表达。同时，实验还同时检测了这8个不同组织部位的总皂苷含量，并对调控基因的表达量与化学成分代谢规律进行探讨：岗梅在各个组织部位中均可合成三萜皂苷；三萜皂苷主要贮存在根部和叶

6、子；茎的贮存量很低，可能为三萜皂苷的转运通道。4AmyrinSynthases的克隆和功能分析在9个注释为OSCs中，unigenel015被注释为a．amyrin合成酶，而两个包含全长CDS的unigenes(CL3079．Contigl和CL481．Conti91)被注释为fl-amyrin合成酶(分别命名为IAAS3079和IaAS481)。通过T-A克隆和GATEWAY技术构建了带特异性标签的Ia,4S3079和IaAS481的酵母表达载体，在酿酒酵母中进行表达和功能分析。Western-blot证明了IAA

7、S3079在酿酒酵母中成功表达了，而未检测到与IaAS481预期大小相近的蛋白条带。用GC．MS分析酵母提取物，发现表达IAAS3079和IaAS481的酵母提取物中均可发现a．amyrin和p-amyrin，二者的比例不同，说明IAAS3079和IaAS481均为多功能AS。IAAS3079的合成产物以a．amyrin为主，约占80％；而IaAS481的合成产物则以∥-amyrm为主，约占95％。利用RACE技术成功扩增得到了unigenel015的3、端方向800bp左右的缺失片段，包括3、端编码区和polyA尾

8、；而5、RACEPCR却没有获得预期结果。本论文利用生物信息学分析和基因工程技术等，从岗梅根转录组数据库中筛选鉴定了一系列可能参与三萜皂苷生物合成相关的候选基因。对这些候选基因的进一步研究，有助于从基因水平揭示岗梅中乌索烷型三萜皂苷的生物合成。乌索烷型三萜皂苷是岗梅的主要化学成分，且具有抗肿瘤和抗病毒等生物活性，可能是岗梅的药效物质基础。从分子