基因打靶与体细胞克隆技术制备乳腺生物反应器的研究进展

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1、中国畜牧兽医2009年第36卷第4期生物技术·65·基因打靶与体细胞克隆技术制备乳腺生物反应器的研究进展袁天杰，杜卫华，郝海生，朱化彬(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193)摘要：在动物乳腺生物反应器研究中，传统方法不可避免地造成基因表达调控元件的人工拼接和外源基因在动物基因组中随机整合所带来的“位置效应”，致使转基因动物外源基因的表达水平不高且差异较大。而基因打靶在外源基因定点整合、消除位点效应方面具有明显优势。体细胞核移植技术可以提前在细胞水平对转基因动物进行筛选，不但可以节省时间，更降低了

2、制备乳腺生物反应器的成本。作者简述了基因打靶与体细胞核移植技术结合制备乳腺生物反应器的优越性、存在问题、解决办法及其应用前景和展望。关键词：基因打靶；核移植；转基因动物；乳腺生物反应器中图分类号：Q785文献标识码：A文章编号：1671-7236(2009)04—0065—04早在1982年，Gorden等建立了第1例乳腺生是2O世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物物反应器小鼠模型，并首次报道在小鼠的乳汁中表学技术，这项技术的实质是对特定的基因序列进行达出人组织纤维酶原激活剂(tPA)。此后，乳腺生定点的

3、分子生物学改造。这些改造包括基因替换物反应器作为药用蛋白质的全新生产模式，成为生(geneknoekin)用一段设计好的序列整合到或替物技术领域发展的重要方向。乳腺生物反应器具有换动物基因组的特定位点，即利用基因转移方法，将能够生产出完全生物活性的药用蛋白，纯化简单，投外源DNA序列导入靶细胞后，通过外源DNA序列资少，成本低等优点，生产的药用蛋白可以获得巨额与靶细胞内染色体上同源DNA序列间的重组，将经济效益。然而在制备转基因动物过程中，外源基外源DNA定点整合入靶细胞基因组某一特定位点因在宿主动物体内的表

4、达大多停留在一个较低水及基因剔除(geneknockout)对某一预先确定的平，且个体间表达水平差异很大。通过基因打靶，可靶位点进行定点突变，从而改变细胞遗传特性以将目的基因定向地送到一个乳蛋白基因座或一个(Capecchi等，1989)。已知可以在乳腺组织高效表达外源基因的座位上，1．2基因打靶策略以达到高效表达的目的。体细胞克隆技术可以降低1．2．1ES细胞基因打靶基因打靶技术具有位点生产乳腺生物反应器动物的成本，这将促进这项技专一性强，打靶后目的片段可以与染色体DNA共术的产业化，于是许多学者开始利用基

5、因打靶技术同稳定遗传的特点。小鼠ES细胞能在体外培养并进行转基因的定位整合研究，基因打靶与体细胞核保留发育的全能性；经过体外基因打靶引入外源基移植技术结合将成为制备乳腺生物反应器的发展因后，重新植回小鼠胚胎，可发育成生殖系携带精确趋势。修饰突变的嵌合体小鼠。这两个特性使基于小鼠胚1基因打靶制备乳腺生物反应器胎干细胞(ES)的基因打靶技术成为一种常规技术1．1基因打靶的原理基因打靶(genetargeting)并得以广泛应用(Muller等，1999)。令人遗憾的是，尽管世界上众多科学家做了很多努力，至今尚未收

6、稿日期：20081l17获得家畜的ES细胞用于基因打靶，成为十几年来作者简介：袁天杰(1981一)，男，河北人，硕士，研究方向：胚胎基因打靶制备乳腺生物反应器研究的限制性瓶颈工程。(Piedrahita等，2000)。通信作者：朱化彬(1965)，男，安徽人，硕导，研究员，从事胚胎1．2．2体细胞基因打靶制备乳腺生物反应器在工程与繁殖生物技术研究。E—mail：huabinzhu@ya—体细胞克隆技术成功之前，科学家们主要将基因打hoo．corn．en靶技术与鼠ES细胞培养技术相结合应用，因为ES基金项目：农

7、业部奶牛产业技术体系项El(nycytx-lO)；跨越计划项目“优质高产奶牛快速高效繁育技术集成与产业细胞发生同源重组(homologousrecombination，化示范”；国家自然基金项目(30700584)。HR)的频率高，而且只有ES细胞才能将这种打靶·66·生物技术中围畜牧兽医2009年第36卷第4期修饰遗传到生殖系，从而获得打靶的纯合动物。代培养、基因打靶、药物加压、高通量筛选中靶细胞2000年7月，PPL公司的McCrearh等(2000)在到核移植需要传代约45次(Clark等，2000)，

8、尽管Nature上报道C0L1A1(原胶原)基因在胎儿成纤传代超过45次的牛成纤维细胞作为核供体，仍具有维细胞内进行基因打靶，在(0L1A1基因内插入了全能性，但衰老的细胞打靶效率降低。更重要的是，IRES和无启动子的”D和a1一antitrypsin(AAT)一个细胞系能够进行基打靶的次数受到了限制，基因，用转基因细胞生产克隆绵羊，使乳中AAT蛋很难进行2次甚至更多次基因打靶。目前，尚未有白含量高