玉米外源抗虫基因转化体创制与表达分析

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1、学校代码学号或申请号密级10459201222161887郑*l夫孚专业硕士学位论文玉米外源抗虫基因转化体创制与表达分析作者姓名：导师姓名：专业学位名称：培养院系：完成时间：林鸿田保明教授铁双贵研究员植物保护生命科学学院2014年5月Athesis(diss酣ation)submittedtoZhengzhouUniVers毋forthedegreeofMaster(doctor)Transf．omingMaizeWithhlsect—resistantGeneandEXpressionAnalysisByHongLin-一Supervisor：P

2、rofBaomingTianShuangguiTiePanltProtectionSchoolofLifescienceMay2014原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：朴鸥嗽刎垆f月砷日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文

3、的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：辙日期：)孵年f且珥日摘要玉米是世界上最重要的粮食作物之一，虫害是造成玉米产量损失的主要原因。传统育种耗时长、效率低，转抗虫基因玉米成为解决虫害的最有效途径之一。本研究根据植物偏爱密码子原则，对

4、野生型苏云金芽孢杆菌CrylF进行人工改造，并在57端前面加上了AdllI的增强子序列。为了初步验证其对玉米螟等害虫的毒性，我们将人工改造后的基因构建到原核表达载体中PET28b中，继而将载体转入大肠杆菌BL2l(DE3)菌株中，进行原核诱导表达。SDS．PAGE电泳显示原核表达诱导出来的杀虫蛋白主要以包涵体的形式存在。免疫试纸条显示C巧lF可溶蛋白的存在。收集原核表达诱导的可溶性蛋白，加入到人工制成的玉米螟饲料中，喂食玉米螟，进行原核表达虫试实验。虫试实验证明，改造后的CrylF显示出很强的杀虫能力，说明Cr)rlF基因人工改造正确。改造正确后的

5、CrylF进一步构建到植物表达载体CPB中，该载体以组成型启动子CaMV35S驱动目的基因，抗除草剂Bar基因作为选择标记基因。采用基因枪介导法遗传转化玉米愈伤组织，经过组织培养得到转基因植株。然后对得到的转基因植株进行分子鉴定。PCR初步筛选出阳性植株，随机选取4株PCR呈阳性的植株进行Southem分子杂交，证明外源基因整合到玉米基因组中。用CrylF免疫试纸条对PCR呈阳性的植株进行检测，试纸条呈阳性，说明转基因玉米植株能够表达出相应的杀虫蛋白。对表达CrylF杀虫蛋白的植株进行室内抗虫实验，证明转基因植株表现出较强的抗虫性。本实验将人工改造

6、后的CrylF基因，通过基因枪介导法得到转基因植株。通过对转基因植株的分子鉴定和室内抗虫实验，证明获得了CrylF蛋白高效表达的转化体，为玉米育种提供抗虫材料。关键词：玉米；抗虫；C巧lF；遗传转化；基因枪AbStraCtComisoneofmostimpon趾t南odcropsi11theworld，Pestd锄ageisthemaillcausevieldlossesofmaize．Traditionalbreedingist油e-consumingandIowe伍ciency，transgenicIm泣ehasbccomeoneofthemo

7、ste位ctiVewaystosolVepestda撇ge．T11ewildBacillusthuringiellsisCr)r1Fgenewasmodifiedaccord啦tophntpre缸虹培codons，andthe5。endprecededbyaAdhIenhancersequencesthQrdertoveri句itsto妣itytothecomborerandtheotherpests，modi丘edCrylFgenewasclonedintoprok哪oticexpressionvectorPet28b，andthentheVec

8、tortransfomledintoE．coliBL2l(DE3)straill．TheproteineXpression