大豆gmfad3c基因在花生中的表达及分析

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1、山东师范大学硕士学位论文大豆GmFAD3C基因在花生中的表达及分析姓名：翟华东申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：毕玉平;单雷20070409独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特月Ⅱ加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得(注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空)或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：

2、狴铎碌导师签字：2彳a中学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：理绎毫∥2孚导师签字：叮97签字日期：训1年‘月11日签字日期：硼年f月f』臼山东师范大学硕士学位论文摘要必需脂肪酸(essentialfattyacids)在人和

3、高等动物体内不能合成，必须从食物中摄取。其中m亚麻酸(口．Iin01enicacid，ALA，C18：3”t’2r15)和亚油酸(1inole．cacid，LA，C18：2ag,11是研究比较多的必需脂肪酸，*亚麻酸属于n-3多不饱和脂肪酸(PUFAs)．它在体内经过一系列的脱氢和加长反应可以生成EPA、DHA等其它n-3PUFAs。亚油酸属于n-6多不饱和脂肪酸(PuFAs)，经过一系列反应可以生成—r-亚麻酸(y-linolenieacid，GLA)、花生四烯酸(aracMdonieacid，AA)等其他n-

4、6PUFAs。n_6和n-3PUFAs的功能在很多方面是相反的，它们相互协调制约，共同调节生物体的生命活动。所以n-6／n-3PUFAs的膳食平衡非常重要，但是人的膳食中该比值一般严重偏高，Ⅱ．6PUFAs相对过量，n-3PUFAs严重缺乏。这导致高血栓，动脉粥样化，癌症的发病率增加，炎症增强等症状。所以对油脂的研究方向应该是降低n-6／n-3PUFAs的比值，使其更加有利于人们的健康。对PUFAs的研究在分子生物学上体现在对PUFA3合成酶的研究。本试验所应用的酶即是催化由LA向ALA转化的酶。花生是世界第四大

5、油料作物，作为我国的主要油料作物，其总产居各油料作物之首。我国花生50％以上用于榨油，花生油中LA的比例为15％-43％，却不含任何n-3PUFAs。因此通过转基因方法使得花生表达相关基因，促使部分LA转变成AI^．是改变花生种质的一种有效方法．大豆(GlycineMD。种子油中ALA含量较高。BilyeuKD等2003年克隆了大豆GmFAD3基因。在未成熟种子中，GmFAD3A和GmFAD3C的表达量分别是持家基因的60％和0．2％，GmFAD3B未检测到表达。并且他们发现C^nF／LD3A是大豆种子油中ALA

6、水平主要贡献者，其贡献量是GmFAD3C的三倍。后来他们又发现GmFAD3A完全突变后，花生油中Ⅱ．亚麻酸减少量大约为468Kg‘1油【1】；而GmF．AD3C完全突变后，花生油中m亚麻酸减少量大约为159Kg"‘油。前者是后者的三倍。也就是说，GmFAD3A拥有300倍于GmFAD3C的表达量，却只有3倍于GmFAD3C的*亚麻酸贡献量。由此可以推测，相同量的GmFAD3C与GmFAD3A的m亚麻酸贡献量之比为10011，因此G-mFAD3C比OmFAD3A的活性要强的多，GmFAD3C分子比GmFAD3A分子

7、更稳定．在大豆种子中，活性很高的GmFAD3c表达量很低，而活性极低的GmFAD3A表达置却极高。植物主要靠过量表达一个活性低的¨3脂肪酸脱氢酶来贡献*亚麻酸，而不是稍微多表达一点GraFAD3C。这其中的机制尚待进一步研究。因此本试验采用活性较高的GmFAD3C基因，在其表达后能够更容易分析花生中脂肪酸含量的变化。本实验用RT-PCR方法从大豆未成熟种子中扩增出GmFAD3C的eDNA，连入pUCm-T，得pUGFAD3C。最后连接到植物表达载体pROKII中，建成了pROKllFAD3C重组载体，转化到农杆菌

8、EHAl05中，通过农杆菌介导转化花生丰花3号，用胚轴和子叶作为外植体，经过比较后发现胚轴作为外植体较为优异，由此建立了丰花3号的遗传转化体系。经过卡那霉素的筛选得到抗性苗，提取抗性苗的基因组DNA，用PCR以及PCRsoufl'mrn鉴定出了转基因植株。一方面通过气相色谱分析花生脂肪酸成份的变化可以进一步证明GmFAD3c的功能，另一方面，本工作可以在用分子生物学方法提