线粒体dna在百草枯中毒机制中作用

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1、线粒体DNA在百草枯中毒机制中作用【摘要】目的利用体外实验研究线粒体DNA（mtDNA）在百草枯（PQ）致病机理中的作用。方法首先用PQ处理人II型肺泡上皮细胞（A549细胞），应用CCK-8法检测细胞生存率，然后利用绝对定量PCR的方法检测培养上清液中mtDNA的含量，以激光共聚焦成像法检测线粒体膜电位来验证PQ对线粒体的损伤作用。接着通过Transwell趋化实验检测mtDNA对人外周血单个核细胞（PBMC）及中性粒细胞（PMN）的趋化活性，并用流式细胞术确定趋化细胞的亚型。同时应用Xcelligence系统和体外血管通透性试剂盒检测了mtDNA对血管通透性的影响。最

2、后验证mtDNA在细胞增殖方面的作用。结果PQ致A549细胞损伤的半数致死浓度为600umol/L,且A549细胞的生存率及对线粒体的损伤存在浓度和时间依赖关系（P【Keywords]Paraquat；MitochondrialDNA；Inflammationresponse；Cellproliferation；Peripheralbloodmononuclearcells；Neutrophils；Mitochondrialmembrancepotential；Vascularpermeability；TransformingGrowthFactor-Beta1百草枯（p

3、araquat,PQ）是一种广泛使用的有机杂环类接触性脱叶剂及除草剂。它可以导致哺乳动物严重的肺损伤，主要表现为间质水肿，白细胞浸润，肺泡出血，纤维细胞增殖和胶原沉积的增多[1],这些损伤可以导致哺乳动物的死亡。在人类也有相似的一个炎症过程发生，从破坏性阶段存活下来的患者将会发展至第二个增殖阶段，最终患者以呼吸衰竭死亡，病死率极高（75%〜100%）[2]。截至今日，虽然PQ中毒的毒理机制仍不明了，但所有学者已达成共识的是PQ中毒的早期阶段就是一个炎症反应过程。最近线粒体DNA（mtDNA）在各种炎症反应中的作用引起了很多学者的关注，并已经有很多研究显示了mtDNA在炎症

4、反应中的关键作用，但mtDNA在PQ中毒所致炎症反应的作用还没有人做过研究，因此本文拟探讨mtDNA在PQ所致肺损伤及纤维化中的作用。1材料与方法1.1细胞及试剂A549细胞株、HFL1细胞株（中科院上海细胞库），HUVEC细胞株（上海仁济医院消化所馈赠）。百草枯（美国Sigma公司）。RPMI1640、谷氨酰胺、0.25%胰酶-EDTA、胎牛血清（美国Gibco公司）,100U链霉素-青霉素、磷酸盐缓冲液（中国Hyclone公司）。SYBRPremixExTaqTMPefectRealtime试剂盒（日本TaKaRa公司）。cellcountingkit-8（日本Doj

5、indo公司）。Anti-HumanCD14APC、Anti-HumanCD19PE、Anti-HumanCD3FITC（美国eBioscience公司）。InVitroVascularPermeabilityAssay（美国Millipore公司）。1.2主要仪器SterilGardIlladvance洁净工作台（美国Baker公司），5%C02电热恒温培养箱（美国NAPCO5410）,倒置显微镜（日本NIKON）,GeneAmpPCRSystem9700、ABIPrism7900SequencerDetector（美国AppliedBiosystems公司），酶标比色

6、仪（美国Model550,Bio-RAD）,流式细胞仪（美国，BDFACSCalibur）XcelligenceRTCA（瑞士Roche公司）。1.3方法1.3.1细胞培养人II型肺泡上皮细胞A549细胞，人肺成纤维细胞HFL1细胞，人脐静脉血管内皮细胞HUVEC细胞在含10%胎牛血清+1.0mmol青链霉素+1.0mmol谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中传代培养，培养细胞置于37°C,5%C02培养箱中，待细胞长满单层后，用0.25%胰酶-EDTA消化，1:2或1：3传代培养，选取对数生长期细胞进行实验处理。1.3.2百草枯处理后A549细胞生存率及mtDNA的含量

7、测定A549细胞以20000个细胞/孔种在96孔板，设正常组及100、300、600、800、1000umol/L5个浓度组及0、1、2、4、8、12、24、48、72h几个时间段，测定出终实验处理浓度及时间，每组设定3个复孔。细胞经过不同时间不同浓度处理后，用PBS冲洗每孔后加入100PL新鲜培养液和10uLCCK8,置入37°C,5%C02培养箱培养1h后，酶标仪上读取490nm波长时的0D值，细胞生存率二［（实验孔-空白孔）/（对照孔-空白孔）］X100%,其中空白孔为不含有PQ和细胞的CCK8培养液。在mtDNA的检测