促红细胞生成素对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性作用机制的研究

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1、中国医科大学（辽宁）博士学位论文促红细胞生成素对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性作用机制的研究姓名：刘坤申请学位级别：博士专业：神经生物学指导教师：薛一雪2011-04·中文论著摘要·促红细胞生成素对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性作用机制的研究．▲L-JL刖昌缺血性脑血管病以其高发病率和高死亡率而严重危害着人们的健康。迅速溶栓进行再灌注是治疗的关键。但快速溶栓会引起脑组织继发性的损害，其主要原因是血脑屏障(bloodbrainbarrier，BBB)通透性遭到破坏。BBB破坏严重，会加重脑水肿。因此应用一种能够降低缺血再灌注后BBB通透性的药物，对于改善临床脑缺血患者的预后是

2、非常有益的。促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种主要由肾脏分泌的糖蛋白，其主要作用是调节血液中红细胞的生成。最近研究发现，在正常人脑和缺血脑组织的神经胶质细胞、神经元和内皮细胞均有EPO及其受体表达。利用创伤性脑损伤及缺血再灌注动物模型研究发现，EPO具有神经保护作用，可以减小脑梗死体积，使BBB通透性下降，减轻脑水肿程度。目前，关于EPO保护缺血再灌注后BBB的作用机制尚不清楚。紧密连接(tightjunction，TJ)是保持BBB完整性的重要结构和功能基础。TJ相关蛋白zO一1、occludin、claudin一5是目前研究TJ的标志蛋白，他们

3、的变化直接影n晌JTJ的状态，进而影响BBB的通透性。研究已经证明，脑缺血时TJ相关蛋白zO．1、occludin、claudin一5表达均减少，TJ完整性下降，细胞旁通透性增加，直接导致血管源性脑水肿的发生。泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin—proteasomepathway,UPP)是细胞内蛋白质选择性降解的途径，26S蛋白酶体在这一降解通路中起重要作用。26S蛋白酶体由20S核心蛋白酶和19S调节颗粒组成。20S又由2个cc亚基和2个B亚基构成，其中0【亚基主要用于底物的识别，并促使底物进入水解中心。在受刺激的细胞中，核转录因子一KB(nuclearfactor

4、-rB，NF．KB)的抑制因子0【亚基(IKBa)形成多聚泛素化并被降解，从而使NF—KB活性增强。肿瘤坏死因子a(tumornecrosisfactoralpha，TNF．0【)是一种前炎性细胞因子，与多种疾病的发生有关。同时也是NF．KB调节的物质之一，NF—KB使其表达活性增强。近年研究发现，TNF．a具有调节TJ相关蛋白表达和降解的作用，因此可以改变BBB通透性。本研究应用脑缺血再灌注大鼠模型，腹腔注射EPO，研究脑缺血再灌注后，EPO对BBB通透性的影响及其可能的作用机制。方法1、大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的制备。2、应用激光多普勒血流仪检测血流变化。3、氯化三苯

5、基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride，an'c)染色法检测脑梗死体积百分比，观察脑组织损伤情况及EPO的影响。4、伊文氏蓝(evansblue，EB)检测EPO对脑缺血再灌注BBB通透性的影响，透射电镜观察脑微血管内皮细胞问TJ的状态。5、RT-PCR法检测EPO对缺血再灌注脑组织微血管段的TJ相关蛋白ZO．1、occludin、claudin．5和TNF一0【mRNA表达的变化。6、免疫组织化学法检测EPO对脑缺血再灌注后TJ相关蛋白ZO．1、occludin和claudin．5分布和表达的作用。7、免疫组织化学方法和免疫组织荧光

6、方法检测EPO对脑缺血再灌注脑组织中20Sa、IKBa分布和表达的作用。8、Westernblot法检测EPO对脑缺血再灌注脑组织微血管段的TJ相关蛋白ZO．1、occludin、claudin一5及20Sa和IKBu表达的调节作用。9、ELISA法检测EPO对脑缺血再灌注脑组织微血管段的TNF．a浓度的影响。结果1、脑缺血再灌注3h、72h，EPO使大鼠脑梗死体积显著降低。2、脑缺血再灌注3h、72h，缺血区脑组织微血管内皮细胞间TJ丌放，BBB通透性显著升高；EPO基本恢复了TJ的完整性，使BBB通透性显著下降。3、脑缺血再灌注3h、72h，缺血区脑组织微血管段的TJ相

7、关蛋白ZO一1、occludin和claudin一5mRNA及其蛋白表达显著下降，EPO使三种蛋白表达显著升高，并沿脑微血管分柿明显增多。4、脑缺血再灌注3h、72h，缺血区脑组织微血管段的TNF．0【mRNA表达上调及浓度升高，EPO显著下调TNF．amRNA表达水平并降低其浓度。5、脑缺血再灌注3h、72h，缺血区脑组织微血管段的20Set蛋白表达和活性显著升高，EPO使20Sa的表达显著降低。6、脑缺血再灌注3h、72h，缺血区脑组织微血管段的IKBa蛋白表达显著降低，EPO显著抑制缺血再灌注引起的IKBa蛋