肠出血型大肠埃希菌o157h7 tir--c在大肠杆菌和嗜酸乳杆菌中的表达研究

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文肠出血型大肠埃希菌0157：H7Tir-C在大肠杆菌和嗜酸乳杆菌中的表达研究StudyonExpressionofTir--CofEnterohemorrhagicE．coliO157：H7inEscherichiacoliandLactobacillusacidophilus课题来源：国家自然科学基金资助项目(No．31300762)广东省医学科学技术研究基金(No．B2012206)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委员会主席答辩委员会成员

2、余芳龙北国教授范宏英副教授病原生物学学术型研究生公共卫生与热带医学学院彭涛教授吴英松教授芮勇宇教授赵卫教授寇晓霞副研究员2014年5月20日广州肠出血型大肠埃希菌0157：H7Tir．C在大肠杆菌和嗜酸乳杆菌中的表达研究硕士研究生：余芳指导老师：龙北国教授范宏英副教授摘要一、研究背景和目的肠出血型大肠埃希菌(enterohaemorrhagicE．coli，EHEC)0157：H7是一种主要经消化道传播的病原菌，可引起出血性肠炎(haemorrhagiccolitis，HC)、溶血性尿毒综合症(h

3、emolyticuremicsyndrome，HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(thromboticthromobocytopenieporpura，TTP)等并发症，重者可致死亡，其感染的病死率为0％,--10％。自从Rileyl983年首次报道由EHEC0157：H7引起的出血性肠炎暴发以来，该菌引起的暴发流行不断发生并呈上升趋势，已成为全球性公共卫生问题。因此，预防和控制EHEC0157：H7感染十分重要。目前，针对EHEC0157：H7感染尚缺乏有效的防治方法，一般采取对症治疗。尽管EHE

4、C0157：H7对大多数抗生素比较敏感，但其被抗生素杀死后，可释放志贺毒素，加剧患者并发HUS的危险性。因此，对使用抗生素治疗应采取慎重态度。鉴于EHEC0157：H7暴发流行的严重性和抗生素治疗上的困难，疫苗的研究极为重要。EHEC0157：H7的致病性主要体现在细菌的黏附定植力和毒素两个方面，而转位紧密黏附素受体(Translocationintiminreceptor,Tir)是0157：H7的一种重要毒力蛋白，经EHECIII型分泌系统(TypeIIIsecretionsystem,TTS

5、S)分泌并转位进入宿主细胞，定位于细胞膜上，与紧密黏附素结合后，可引起宿主细胞多中文摘要聚肌动蛋白聚合，造成黏附局部微绒毛刷状缘破坏，形成特征性的黏附和擦拭损伤(attachingandeffacinglesion，A／Elesion)，即Tir在EHEC0157：H7的定植感染过程中起着重要的作用。因此，阻断EHEC0157：H7感染的黏附初始阶段，可避免黏附和擦拭性损伤的发生，从而终止感染。本研究从NCBI网站GenBank上查到EHEC0157：H7标准株EDL933转位紧密黏附素受体完整的

6、编码区(cds)基因序列(AccessionnumberNC002655．2)和氨基酸序列(proteinidNP290261．1)，利用生物信息学在线工具和抗原表位分析软件，预测分析其蛋白结构和抗原特性，从Tir基因全长中选取抗原表位分值高的基因进行研究(命名为n卜C)；设计特异性引物，扩增目的基因Tir．C；将目的基因连至PET-30a(+)载体上，构建重组原核表达质粒PET-30a(+)．Tir-C，转化至大肠埃希菌BL21／DE3，诱导表达和纯化重组蛋白Tir．C：将目的基因克隆入乳酸菌高

7、效组成型表达质粒PMG36e中，获得重组质粒PMG36e．Tir-C，经电穿孔法将该重组质粒转化至嗜酸乳杆菌中，构建表达EHEC0157：H7Tir-C基因的重组嗜酸乳杆菌活载体疫苗；进一步用原核表达的Tir-C蛋白、表达EHEC0157：H7Tir-C基因的重组嗜酸乳杆菌、重组嗜酸乳杆菌结合原核表达的Tir-C蛋白分别免疫小鼠，观察亚单位疫苗和重组载体疫苗的免疫原性及免疫保护性，探讨与比较预防EHEC0157：H7感染最有效的疫苗，为发展新型疫苗提供实验依据。二、研究方法1．EHEC0157：H

8、7Tir基因的生物信息学分析从NCBI网站GenBank上获得EHEC0157：H7标准株EDL933Tir完整的编码区基因序列和氨基酸序列；运用InterProScan分析Tir氨基酸序列；同时使用两种B细胞表位在线分析软件(http：／／www．imtech．res．in／raghava／abcpred／与http：／／www．cbs．dtu．dk／services／bepipred／)预测陆蛋白的B细胞表位。2．目的基因Tir-C的原核表达2．1目的基因Tir-C克隆载体的构