枣疯病植原体实时荧光定量pcr检测方法的研究

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1、70生物技术通讯LEq3"ERSINBIOTECHNOLOGYVo1．21No．1Jan．，2010doi：10．3969~．issn．1009—0002．2010．01．017研究报告枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测方法的研究侯立华，黄新，朱水芳1．沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳110161；2．中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所，北京100029[摘要]目的：建立枣疯病植原体拷贝数检测实时荧光定量PCR方法，为枣疯病植原体定量检测提供技术支持。方法：构建质粒标准品，设计实时荧光PCR探针引物，优化体系，建立标准曲线，并进行重复性验证。结果：制备了枣疯

2、病植原体标准质粒，建立了稳定的质粒标准品检测体系(RZ=0．998，检测限10拷贝，定量限100拷贝)。结论：实时荧光定量PCR检测方法重复性好，可用于枣疯病植原体的拷贝数检测，为枣疯病植原体检验检测和病害防治提供了技术支持。[关键词】实时荧光PCR；枣疯病植原体；拷贝数[中图分类号]Q78[文献标识码]A[文章编号]1009—0002(2009)01—0070—03TheQuantitativeDetectionMethodofjujubeWitchesBroombyReal-TimePCRHOULi-Hua2，HUANGXin：,ZHUShui-n1．Colleg

3、eofBiotechnology，ShenyangAgriculturalUniversity，Shenyang110161；2．InstituteofAnimalandPlantQuarantine，ChineseAcademyofInspectionandQuarantine，Beijing100029；China[Abstract]Objective：ToestablishthequantitativedetectionmethodofJujubeWatchesBroom(JWB)byreal-timePCR，andprovideatechnicalsuppor

4、tfortheJWBdetection．Methods：Standardplasmidwasconstructed，andthenasetofprimersandprobewasdesigned．Optimizingthereal-timePCRsystem，thestandardcurvewascreated．Thereproducibilitywasalsoverified．Results：Thestandardplasmidwasconstructedsuccessfully，andastabledetectionsystemwassetup．Inthisdet

5、ectionsystem，theLODis10copiesandtheLOQis100copiesfcoeficientofdeterminationR=0．998)．Conclusion：ThissystemhasasuficientrepeatabilitythatcanbeusedasaquantitativestudyandalsocanprovidetechnicalsupportforthedetectionandpreventionofJWB．【Keywords】real-timePCR；JujubeWitchesBroom；copynumber我国枣树

6、栽培范围极广，以山东、河北、山西、病植原体与樱桃致死黄化植原体、重阳木丛枝植原陕西、甘肃、安徽、浙江产量最多。到2006年，中国体等同为第V组成员。枣树栽培面积达150万hm，年产量达200万吨，占随着分子生物学技术的发展，PCR方法已被广世界枣树种植面积和产量的98％以上，国外进口枣泛应用于植原体的检测鉴定，其中包括实时荧光几乎都来自中国口]。在枣树病害中，枣疯病(JujubePCR技术。实时荧光PCR是在常规PCR体系中加WitchesBroom)发生普遍，并且由于其防治难度入了一条Taqman探针。Taqman探针5端标记有荧大，具有毁灭性[21，全国每年因枣疯

7、病致枣树死亡带光分子，3端标有淬灭基团。在PCR扩增过程中，与来的损失达数亿元f3]。模板DNA配对正确的TaqMan探针在DNA聚枣疯病是由枣疯病植原体所引起的病害。植原合酶的5端外切酶活性作用下将荧光分子切下，即体(phytoplasma)原称类菌原体(mycoplasma-like可检测荧光信号。实时荧光PCR具有高灵敏度、快organism，MLO)，为单细胞原核生物，无细胞壁，由生物膜包围，可引起多种病害[41。根据Wei等[53的研[收稿日期]2009-07-07究，以植原体16SrDNA基因序列为对象进行分析，[基金项目]国家自然科学基