雷公藤甲素对appps1双转基因ad模型小鼠海马内老年斑形成和炎症反应的影响

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1、中南大学博士学位论文雷公藤甲素对APP/PS1双转基因AD模型小鼠海马内老年斑形成和炎症反应的影响姓名：雷德亮申请学位级别：博士专业：神经生物学指导教师：罗学港20070501博士学位论文中文摘要摘要研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’Sdisease，AD)I}勺脑内病变是一个慢性炎症的观点，已经普遍被人们接受。AD脑内慢性炎症反应的特征包括：与13一淀粉样蛋白(13-amyloid，Ap)沉积和老年斑(senileplaques，sP)形成有关的小胶质细胞激活，反应性星形胶质细胞增生，以及补体成份和致炎性细胞因子的表达增加等。非甾体类抗炎药(non

2、．steroidalanti—inflammatorydrugs，NSAIDs)不仅可以降低AD发生的危险性，而且可以延缓AD的进程。动物实验研究证实，NSAIDs可以抑制AD转基因模型小鼠脑内Ap的沉积和sP的形成，并抑制小胶质细胞活化和反应性星形胶质细胞增生以及IL—l13等致炎性细胞因子的表达与分泌。因此，抗炎治疗AD具有重要的价值。但是，由于NSAIDs严重的毒副作用，可能限制其在临床上的使用。雷公藤甲素(triptolide，TIO)是中药雷公藤提取物的有效成份之一，具有抗炎和免疫抑制的作用，临床上被应用于治疗风湿和类风湿关节炎，系统性红斑狼疮等自

3、身免疫和炎症反应性疾病。不少的体外研究证实，雷公藤甲素的抗炎和免疫抑制效应是通过抑制炎症介质如I乙．1B、n旺a等的表达释放和抑制诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)和环氧化酶-2(Cyclooxygenase一2，COX一2)诱导表达实现的。最近的研究表明，雷公藤甲素具有神经保护作用，可以保护中脑黑质多巴胺能神经元免受脂多糖(1ipopolysaccharide，博士学位论文中文摘要LPS)的损伤，其机制可能与雷公藤甲素抑制LPS所致的小胶质细胞的活化以及抑制LPS所致的炎症反应有关。T10对AD脑内炎症

4、和免疫反应影响的研究，到目前为止还少见有文献报道。本研究首次用T10处理B一淀粉样前体蛋白(p—Amyloidprecursorprotein，APP)基因和早老素I(Presinilin1，PSl)基因双转基因AD模型小g(APP／PSldtg)，研究T10对APP／PSldtg的影响，探讨T10治疗AD的可能性及其可能机制，为AD的防治提供新的方法。目的研究雷公藤甲素(T10)对APP／PSl双转基因AD模型小鼠海马内Ap沉积与SP形成、小胶质细胞和星形胶质细胞的活化以及COX-2诱导表达的影响及其可能机制，为T10防治AD提供新的理论依据。方法1．动物

5、实验取18只4．5月龄健康雄性APP／PSl双转基因AD模型小鼠，随机分为3组，分别腹腔注射5p．g／kg．dT10(T10H组)、1肛g／kg．dT10(T10L组)和等容量的溶媒(PLC组)共计45天；另取5只野生型非转基因同龄雄性小鼠，不作任何处理作为对照。45天后取材，左侧半大脑用于组织学染色，右侧半大脑用于蛋白分析。组织学研究：按无偏性体视学(Unbiasedstereology)SUR原则(Systematic—Uniform-Randomprinciple),每10片取1片收集切片，6E10、GFAP、MACl、COX-2免疫组织化学方法染色结

6、合无偏性体视学定量分析研究AB、星形胶质细胞、小胶质细胞和COX．2等的变化，刚果红染色显示老年斑形成的改变，6E10与GFAP、6E10与Ⅱ博士学位论文中文摘要MACl、COX．2与GFAP、COX一2与MACl等免疫荧光双标记显示星形胶质细胞和小胶质细胞与AB和COX．2等的关系。WesternBlot蛋白分析海马AB和COX-2等蛋白水平的变化。2．细胞培养实验：(1)培养A172人星形胶质细胞，分别用0．2、1和5嵋几T10预处理A172细胞1ll，随后用lmg／LLPS处理细胞3h和6h，逆转录一PCR(Reversetranscription-P

7、CRRT-PCR)、Westernblot研究不同浓度T10对LPS所致COX-2表达的影响：电泳迁移率检测(ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA)研究T10对LPS所致的NF—nB／DNA结合活性的影响。(2)培养高表达人类COX一2蛋白(hCOX-2)的sf-9细胞系，分别用T10、COX-2酶活性抑制剂NS398和吲哚美辛处理细胞，放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)检测培养液中PGE2的含量，研究T10对COX-2酶活性的影响。结果1动物实验结果：(1)T10处理APP／PSldtg45d，①可

8、以抑制Ap在海马的沉积，减少SP的形成。无偏性体视学