igrp206-214h--2kd单链三聚体的酵母表面展示及其初步鉴定

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1、IGRP206214H．2Kd单链三聚体的酵母表面展示及其初步鉴定YeastcellsurfacedisplayIGRP20每214H．2Kdsinglechain‘ll‘●●●·⋯‘triinerandprehmlnaryldentitication研究生：伏娇导师：季明春教授扬州大学二零一四年五月伏娇：IGRP20睨14H一2Kd单链三聚体的酵母表面展示及其初步鉴定IGRP206-214H一2Kd单链三聚体的酵母表面展示及其初步鉴定中文摘要酵母细胞表面展示系统是将异源蛋白质进行固定化表达的真核展示系统。其基本原理是将特定的载体基因序列与外源靶蛋白基因融合

2、后利用化学转化、电转化等方法转化酵母细胞，融合蛋白在酵母细胞中诱导表达后，由信号肽引导向细胞外分泌。由于融合蛋白含有锚定酵母细胞壁的结构，可将融合蛋白锚定在酵母细胞壁中，从而将外源蛋白分子固定化表达在酵母细胞表面。同时，可以使用还原剂打开Agalp和Aga2p之间的二硫键而洗脱融合蛋白，通过Aga2p展示目的蛋白在从酵母表面洗脱后能够大大减少蛋白与细胞壁上其它分子结合的几率。酵母表面展示系统的优势在于：遗传操作方便；表达的外源蛋白可在酵母细胞内进行折叠、糖基化等翻译后修饰；此外，酵母不仅廉价且易于培养。单链三聚体(singlechaintrimer，SCT)

3、是利用寡核苷酸肽链将MHCI类分子重链、f12m链、细胞毒性T细胞(CTL)表位肽应用分子生物学技术连接起来的复合物。SCT在介导细胞免疫时，能够避开复杂的抗原处理过程，使抗原表位和MHC分子的抗原槽内紧密结合，而难以被其他抗原肽替代从MHC分子表面脱离，从而增加了对特异性T细胞受体(TCR)的激活活性。I型糖尿病(TID)是一种器官特异性自身免疫性疾病。葡萄糖．6．磷酸催化亚基相关蛋白(IGI冲)是在I型糖尿病的发病进程中出现的自身抗原，有报道发现将特异性四聚体偶联毒素选择性清除IGRP206-214特异性CTL，对NOD小鼠I型糖尿病的发生具有显著的延缓

4、作用。针对酵母展示系统和单链三聚体技术的种种优点，为了探索IGRP206-214的单链三聚体是否能够在酵母表面展示以及展示前后对NOD小鼠体内IGRP特异性CTL的影响，本研究选取实验室前期构建IGRP206．214H．2KaSCT为研究对象，利用酵母表面展示系统，观察酵母展示对IGRP206-214H．2K'tSCT对特异性CTL的影响。我们首先以实验室前期构建的IGRP206-214H．2KaSCT真核表达载体为基础，进一步构建IGRP206．214H．2KdSCT-pCT302酵母表达载体，然后利用电转化方法转化酵母细胞，用H．2Kd的抗体标记，通过流

5、式细胞术确定IGRP206-214H．2KdSCT能够表达在酵母细胞表面。为了探索IGRP206-214H．2KdscT对NOD小鼠体内IGRP特异性CTL的影响，我们制备了IGRPH．2Ko四聚体，用于检测NOD小鼠体内特异性CTL的变化。我们选用NOD小鼠扬州大学硕士论文2作为实验对象，以BALB／c小鼠作为阴性对照，来证明制备的四聚体的有效性。经过实验发现NOD小鼠IGRP206-214四聚体阳性CD8+阳性的细胞要高于BALB／c小鼠，且存在统计学的差异，证明了我们制备的此四聚体能够用于IGRP206-214特异性CTL的检测。我们取12周龄的NOD

6、鼠脾脏细胞并制成单细胞悬液，利用自制的IGRP206．214Tetramer分析酵母展示前后IGRP206．214H一2KdSCT对IGRP206．214特异性CTL的影响。结果显示酵母表面表达IGRP206-214H．2KdSCT能够活化IGRP206．214特异性CTL并能够增高IGRP206-214特异性CTL频率表明IGRP206-214H．2KdSCT可能具有诱导IGRP2嘶214特异性CTL增殖的功能。在本研究中，构建了能够分泌表达MHCI酵母工程菌，为酵母胞外分泌表达其它的重组颗粒提供了参考，为克服酵母胞内表达出现的难以纯化的难题提供了新的途径

7、．全文证明了IGRP206．214H．2KdSCT能够表达在酵母细胞表面，并且酵母表面展示IGRP206．214H．2KdSCT能够对IGRP206-214特异性CTL具有活化和增殖的影响，这为进一步研究I型糖尿病提供了新思路。关键词：酵母展示jNOD小鼠；IGRP206-214H．2Kd单链三聚体；IGRP2睢214H．2Kd特异性CTL；I型糖尿病；YeastcellsurfacedisplayIGRP206．214H一2singlechaintrimerandpreliminaryidentificationAbstractcellsurfacedis

8、playsystemisaneukaryoticdi