肌萎缩侧索硬化转基因小鼠腰髓神经根损伤机制的探讨

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1、河北医科大学硕士学位论文肌萎缩侧索硬化转基因小鼠腰髓损神经根损伤机制的探讨姓名：王倩申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：李春岩201203中文摘要肌萎缩侧索硬化转基因小鼠腰髓神经根损伤机制的探讨摘要目的：肌萎缩侧索硬化(Amyotrophiclateralsclerosis，ALS)是一种选择性侵犯上、下运动神经元的慢性进行性疾病。临床特征是上、下运动神经元受损的症状并存，而感觉和括约肌功能一般不受影响，其发病机制尚不明确。约5．10％为家族性ALS(familialALS，fALS)，90．95％是散发性ALS(sporadicALS，sALS)。fALS和sALS的临床表现很相似

2、，大约20％fALS病例及4％sALS病例与铜锌超氧化物歧化酶(Cu／Znsuperoxidedismutasel，SODl)突变有关，其中以G93A位点突变最常见，即在基因密码子第93位点甘氨酸代替丙氨酸。SODl．G93A转基因小鼠表现为进行性运动神经元变性，与人类ALS相似，是世界上研究ALS的公认动物模型。对ALS的诊断主要是依据典型的临床症状、起病形式、肌电图改变等口1998年重新修订的ALS的ElEscorial诊断标准中没有明确的指出要排除感觉系统的受损，但目前临床医生在诊断ALS时有一条重要的依据是没有感觉障碍。上世纪九十年代有报道ALS患者出现感觉障碍【l】。此后又有病例

3、报道描述了ALS患者中出现感觉系统的损伤，表现感觉神经元变性、神经传导速度降低、轴索损伤、深感觉和触觉异常【2硼。对fALS的经典模型SODl．G93A转基因小鼠研究发现其有感觉系统的损伤，感觉神经元、感觉神经和脊髓后索均有受累【5】。这些研究结果挑战了目前对该病的普遍认识。本研究在此基础上，应用HE、甲苯胺蓝和银染色法研究了SODl．G93A转基因小鼠腰髓神经根的形态学变化，应用免疫印迹法研究突变SODl蛋白、自噬标示物LC3II和P62、氧化应激标示物HO．1和GCLC随病程进展的表达变化，探讨其在SODl．G93A转基因小鼠腰髓神经根中的变化规律，研究感觉和运动根受累的差异性并初步探

4、讨其损伤机制，为以后ALS的诊断和鉴别诊断提供实验依据。方法：1转基因鼠的繁殖SODl．G93A转基因鼠均饲养在恒温(25．27℃)、恒湿、无特定病原菌中文摘要(specificpathogenfree，SPF)环境中，以灭菌的SPF级颗粒型鼠类饲料、无菌水进行喂养。动物实验过程遵守河北省实验动物管理办法规定。为维持B6SJL．TgN(SODl．G93A)1Gur转基因小鼠突变基因稳定下传，将B6SJLSODl．G93A／+半合子雄鼠与B6SJLFl／J雌鼠交配繁殖，两种小鼠均购自美国Jackson实验室(BarHarbor,ME，USA)，最初由Gumey等研制。子代鼠尾部组织在三周左右

5、经PCR基因扩增鉴定，确定是否携带有hSODl基因。2运动功能评分及实验分组2．1运动功能评分运动功能评分从小鼠50天开始每天评分一次。采用4分评分系统。(1)4分无运动障碍，无体重减轻；(2)3分悬尾时后肢震颤；(3)2分步态异常；(4)1分至少一侧后肢拖拽；(5)0分将小鼠仰或侧卧，30秒内不能翻正。2．2实验分组依据SODl．G93A小鼠的发病规律分为症状前期(60天)、症状早期(100．120天)和终末期(130．150天)3个时间点取材。模型组为SODl．G93A转基因小鼠，对照组为成年非转基因同窝对照小鼠，每组每个时间点6只小鼠。症状前期组取自出生后60天，体重无减轻且无临床症

6、状，评分4分。症状早期指体重开始减轻、出现步态异常，评分2分。终末期指小鼠体重减轻20％以上，仰卧30秒不能翻身，评分0分。3实验方法3．1取材各个时期小鼠用10％的水合氯醛腹膜内注射麻醉后，分别以4％多聚甲醛灌流固定保存或新鲜取腰髓神经根组织迅速投入液氮速冻后于．80。C冰箱保存。3．2HE染色法腰髓神经根经4％多聚甲醛固定后石蜡包埋；切成5岬切片；脱蜡，脱水；苏木精液染色5分钟；流水稍洗去苏木精液1．3秒：1％盐酸乙醇1．3秒；蒸馏水洗1．2秒；O．5％伊红液染色1．3分钟；蒸馏水稍洗1-2秒；中文摘要脱水；透明；封片。3．3甲苯胺蓝染色腰髓神经根经4％多聚甲醛固定后置入1％四氧化锇溶

7、液中孵育l小时；丙酮脱水；环氧树脂812包埋；切成lgrn切片；l％甲苯胺蓝溶液染色10分钟；蒸馏水冲洗，烘干。3．4轴索银染色法腰髓神经根经4％多聚甲醛固定后石蜡包埋，切成129m切片：脱蜡，脱水；置于O．14％硝酸银溶液中，56—60℃孵育24小时；2％硫酸钠和1％对苯二酚处理6分钟；蒸馏水冲洗15分钟后置入1％氯化金溶液中调色；蒸馏水冲洗后置入新鲜配制的2％草酸中10分钟；蒸馏水冲洗后置入5％硫代硫酸钠中孵育3分钟