乙型肝炎病毒聚合酶新功能区发现和意义的研究

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1、论文独创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。作者签名朝嗍论文使用授权声明卫丑』』一一奉人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，f!jj：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名复q人学博十学位论文中文摘要博士学位论文中文摘要博士研究生王

2、勇翔导师闻玉梅乙型肝炎病毒聚合酶新功能区的发现和意义研究乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus。HBV)感染在全球超过3亿人。HBV属于嗜肝DNA病毒科，该科具有部分双链环状的DNA基因组。HBV通过特有的逆转录反应进行复制。HBV编码的聚合酶，逆转录酶(Reversetranscriptase，RE)的结构和功能在其复制过程中起重要作用。但是，至今具有酶活性的HBVRT仍不能足量表达用于体外生化研究和晶体学分析。此外，也没有合适的体外感染系统用于分析复杂的HBV复制周期。通过对分离自乙肝病人的两株B基因型HBV的全基因组克隆和基于细胞转染的复制效

3、率测定，我们曾报道HBVRT第306位脯氨酸(rtP306)置换为丝氨酸或其他氨基酸时，大部分变异体的复制效率下降。为阐明这些变异体复制效率下降的机理，我们首先构建一C基因型毒株的rtP306变异体并转染Huh-7细胞，然后比较变异体与原毒株的复制能力、转录水平和pgRNA包装效率。通过基于细胞转染的复制效率测定发现rtP306变异体复制效率下降，而且F玎变异体与RT缺失复制子“W58。的反式补充实验也证实这一现象。为深入了解复制效率下降的机理，首先分析变异体和原毒株的转录水平，结果显示各rtP306变异体具有相似的转录水平。而且Western印迹显示r

4、tP306氨基酸置换并不影响F玎稳定性。我们通过特异性的PgRNA包装实验和内源性聚合酶反应分析HBVRT的两大主要功能：参与pgRNA包装和催化核苷转移合成子代病毒DNA。pgRNA包装效率用细胞内衣壳颗粒量校正后的衣壳颗粒内pgRNA量表示，细胞内衣壳颗粒用抗衣壳蛋白抗体进行Western印迹测定。包装实验结果显示大部分rtP306变异体的pgRNA包装效率下降。这一结果也被内源性聚合酶反应所确认。同时，通过内源性聚合酶反应发现一些rtP306氨基酸置换导致RT核苷转移酶活性下降。复n人孕博士学位论文中文摘要基于上述发现，我们推测除了rtP306外，

5、rtP306附近的氨基酸(rt304．311)对HBV复制同样重要。通过将rt304-311位氨摹酸置换为丙氨酸或苯丙氨酸构建变异体并测定其复制效率，我们发现n304．311置换确实导致HBV复制效率明显下降。相关机理不是转录水平或RT稳定性改变而是pgRNA包装效率下降。作为对照，远离rtP306的氨基酸(d336和n346)置换不影响病毒复制效率。据我们所知，这是首次报道rt304—311氨基酸保守在pgRNA包装中起重要作用。此外，与原毒株相比，rtY305A变异体对抗病毒药阿德福韦的敏感性下降。阿德福韦据报道作用于HBVRT。手掌。域的酶活性中心

6、，而rtY305置换位于HBVRT。拇指”域，因此药敏实验提示d304-311氨基酸置换可能改变HBVRT构型从而导致与抗病毒药的亲和力下降。此外，通过生物信息学方法分析rt304-311对HBVRT和HBV复制的作用，结果显示：1)预测rt304—311位于HBVRT。拇指”域一螺旋．转角一螺旋结构的转角上，这一螺旋一转角-螺旋结构称为螺旋钳基序；2)转角氨基酸在已报导的基因型A-H毒株中非常保守；3)部分HBVRT转角氨基酸在逆转录病毒RT和丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶的螺旋钳基序中保守。螺旋钳基序是真核生物、细菌和病毒的核酸聚合酶拇指域中一

7、共同的结构元件，在聚合反应时可结合核酸模板和引物。因此，我们通过生物学和结构生物信息学方法确认了HBVRT螺旋钳基序转角(rt304-311)，该转角作为一新功能区可能通过控制HBVRT与核酸的亲和力来调节HBVPgRNA包装效率。人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus．HIV)是逆转录病毒科慢病毒属的研究模型。与HBV相似，HIV也通过特有的逆转录反应进行复制。为研究HIVRT螺旋钳基序转角是否在H

8、v复制中起重要作用，以一HIV前病毒质粒基础上将HIVRT转角置换为丙氨酸。通过单周期感染实验检测各变异体的复制能力。初步结

9、果显示HIv-1转角变异体(m7271A和rtl274A)不能在Jurkat细胞