小盐芥（thellungiella halophila）thcer6基因的克隆与功能研究

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1、山东师范大学硕士学位论文小盐芥（Thellungiellahalophila）ThCER6基因的克隆与功能研究姓名：李宏韬申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：张慧;赵彦修20040428独创声明y598864本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得(注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空)或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者鲐冬眩榀导师签字签字

2、日期：2004年4月79日签字日期：2004年4月撕!警f#眷、导帮厨童向垒茸公孺。小盐芥(Thellungiellahalophila)ThCER6基因的克隆与功能研究小盐芥(Thellungiellahalophila)ThCER6基因的克隆与功能研究摘要几乎所有陆生植物的地上部各器官表面都覆盖有一层蜡质结构。植物表皮蜡质是对植物地上组织外表面的脂质成份的总称，除此之外，还包括植物地下部分及创伤组织的木栓质的基质中及花粉、种皮表面的脂类，其成份主要是饱和的特长链脂肪酸及其衍生物，包括烃、醛、酮、一级醇、二级醇、酯等，还含有甾醇和黄酮类化合物。这些成份是在植物表皮细胞中合成的，然

3、后被分泌到表皮细胞外，自发地形成柱状、棒状、管状、垂直板状、树枝状、伞状等多种形态的蜡质晶体。植物表皮蜡质的化学成份和物理形态如此复杂，说明其对植物有重要的功能，如：限制非气孔性失水、抵御过量紫外线的损伤、抵抗细菌和真菌等病原菌的入侵、参与植物与昆虫的相互作用、参与花粉与柱头的识别等。植物表皮蜡质的生物合成及分泌途径在各种植物中是相当保守的。首先是质体中的脂肪酸从头合成，生成c16或c18饱和脂肪酸；然后是在内质网上的延长及各种衍生物的合成；最后穿过质膜、细胞壁、角质层到达细胞表面。目前只是通过分析已经分离到的几种酶和多种植物的蜡质突变体，来推测其合成和分泌途径。不论是在质体内还是

4、在内质网上，脂肪酸的延长过程是由相似的4步反应循环进行的：缩合、还原、脱水、还原，不同之处只是酰基载体的不同，质体内为ACP，内质网上为辅酶A，反应每循环一次，酰基链增加两个碳原子。内质网上的脂肪酸衍生途径有两条：酰基还原途径(生成一级醇、酯、可能有醛)和脱羰途径(生成醛、烃、二级醇、酮)。拟南芥口rabidopsisthaliana)的AtCER6是质体外蜡质延长途径中一个关键的缩合酶，催化C20一C24脂肪酸的合成。拟南芥的cer6突变体的表皮蜡质严重缺失。小盐芥fThellungiellahalophila)是拟南芥的近缘种，具有与拟南芥相似的遗传特征和生活习性：基因组小(只

5、有7条染色体)、生活周期短(两个月可以完成生活史)、白花授粉、种子多，更具有许多的优势：耐逆性强、表面蜡质多等。人们逐渐开始用小盐芥作为新的模式植物进行植物耐逆等方面的研究。本实验从小盐芥中克隆到一个ThCER6基因，其编码区全长1494bp，编码一个含有497个氨基酸残基的蛋白质，用BLASTx软件将ThCER6与Genbank数据库进行比较，发现该基因同拟南芥中的CER6基因在核苷酸及氨基酸水平上的序列同源性分别为90％山东师范_人学珂!士毕业论文小盐芥(Thellungiellahalophila)ThCER6基因的克隆与功能研究和95％。Southern杂交分析显示，ThC

6、ER6在小盐芥基因组中只含有一拷贝。通过分析ThCER6在不同胁迫条件下的表达模式，发现干旱、NaCI、ABA都可以促进其表达，高温则降低其表达量，说明该基因参与多种胁迫反应。转录后基因沉默几乎存在于所有生物中，不论是植物中的PTGS(PostTranscriptinGenesilence)、动物中的RNAi(RNAinterfering)，还是粗糙脉孢霉中的基N)]三锘O(quelling)，其基因沉默的基本机制是相似的。外源或内源的dsRNA(DoubleStrandRNA，双链RNA)在细胞内被一种类似RNaselII的RNA酶降解为siRNA(SmallIntrepretR

7、NA)，siRNA诱导RISC(RNAInducedSilenceComplex，RNA诱导的沉默复合物)特异地降解同源的目标基因的成熟mRNA，从而抑制该基因的表达。这一现象已经发展为一门技术应用在基因功能的研究中。本实验利用一套基因沉默载体：中间载体—pHANNIBAL，双元表达载体一pART27，特异地抑制小盐芥ThCER6的表达，转基因植株表现出严重的蜡质缺失表型，说明该基因是小盐芥表皮蜡质合成途径中的关键基因，同时用同一载体转化拟南芥，转基因植株同样表现出蜡