第二章 基因工程中常用的工具酶

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1、第二章基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。§2-1核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。核酸内切限制酶

2、的发现及其生物功能（图）一、限制修饰系统的种类（图）二、限制性内切酶的定义、命名1.定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。2.命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：HindⅢ　　前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—HaemophilusinfluensaedⅢSacI(II)—StreptomycesachromagenesI(Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.

3、Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp的地方可以随机地切割DNA分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割b.Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分子。——远距离定点切割c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶，在切割反应过程中，都会沿着DNA分子移动，因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶，一般都是大型的多亚基的复合物，既具有内切酶活性，又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性四、

4、Ⅱ型核酸内切限制酶的特点(1)基本特点：①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列，即所谓的识别序列，并由此切割DNA分子形成链的断裂；——识别序列②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；——9单链切割部位③因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端④此类型核酸内切限制酶比较简单，不需要能量分子ATP，但需加入Mg++离子，而且是从其识别序列内部切割DNA分子⑤在结构上是一种单一的成分，即与Ⅰ型Ⅲ型酶不同，不具有多种亚基成分；(2)识别位点又称切割位点、识别序列或靶子序列。绝大多数Ⅱ型核酸内切限制酶

5、都能够识别由4、5、6或7个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。例如EcoRI识别的序列是GAATTC，我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。呈典型的旋转对称型回文结构(3)平末端与粘性末端由核酸内切限制酶的作用而造成的DNA分子的断裂作用，通常有下列两种不同的方式：两条链上的断裂位置是处于一个对称结构的中心，结果形成——具平末端的DNA片段。Bluntends两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对轴排列，结果形成——具粘性末端的DNA片段。Cohesiveends粘性末端概念(定义)：（图）*是指DNA分子在限制酶的作用下形

6、成的具有互补碱基的单链末端的结构，它们能够通过互补碱基间的相互作用而重新环化起来。(4)限制酶的识别序列与切割频率具4个核苷酸组成的识别序列的限制酶如Sau3A的切割频率为44=256具由6个核苷酸组成的识别序列的限制酶如BanHI的切割频率为46=4096以上假定条件是，在一条随机排列的DNA序列中，假定所有的4种核苷酸都有同等出现的频率，那么任何一种4核苷酸或6核苷酸的识别靶子都有上述的出现频率。(5)同裂酶(isoschizomers)识别同样核苷酸序列的一些来源不同的核酸内切限制酶称为同裂酶。例如HpaI和MspI就是一对同裂酶。同

7、裂酶形成同样的末端。有些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，可用来研究DNA甲基化作用。(6)同尾酶(isocaudamers)一些来源不同、识别的靶子序列也各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，特称为同尾酶。例如BamHI、BglⅡ、Sau3A等即是一组同尾酶。BamHIGGATCCBglⅡAGATCTSau3AGATC*同尾酶在基因克隆中有用处，举例说明：但产生的重组体中原识别位点发生了变化。(7)识别多核苷酸序列的酶例如HindⅡ就是能够识别多种核苷酸序列的一种核酸内切限制酶：5¢-CTPyPuAC-3¢其Py=嘧啶碱基

8、C或T；Pu=表示嘌呤碱基A或G五、影响核酸内切酶活性的因素(1)DNA的分子特性a.限制酶识别位点周围的碱基成分9b.特定DNA分子中所具有的目标限制酶识别位点的密度。c.完全