三种生态型盐芥（thellungiella halophila）表皮蜡质及其合成相关的kcs家族各基因表达分析研究

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1、山东师范大学硕士学位论文三种生态型盐芥（Thellungiellahalophila）表皮蜡质及其合成相关的KCS家族各基因表达分析研究姓名：赵宝申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：赵彦修;张慧20070410山东师范大学硕士学位论文三种生态型盐芥表皮蜡质及其合成相关的KCS家族各基因表达分析研究摘要陆生植物气生器官的表皮覆盖着一层由蜡质形成的脂膜，它主要由特长链脂肪酸的衍生物组成。表皮蜡质的物理化学性质决定它在植物的生活史中起着重要的作用。作为物理屏障，蜡质可以限制非气孔性失水、抵御过量紫外线照射引起的损伤、抵抗细菌和真菌等病原菌的入侵。虽

2、然目前对于蜡质的合成和调节途径还没有定论，但是已经提出许多模式用来解释蜡质的合成与运输途径。植物表皮蜡质的生物合成及分泌途径在各种植物中是相当保守的。首先是质体中的脂肪酸从头合成，生成C16或C18饱和脂肪酸；然后是在内质网上的延长及各种衍生物的合成；最后穿过质膜、细胞壁、角质膜到达细胞表面。目前只是通过分析已经分离到的几种酶和多种植物的蜡质突变体，来推测其合成和分泌途径。不论是在质体内还是在内质网上，脂肪酸的延长过程是由相似的四步反应循环进行的：缩合、还原、脱水、还原，不同之处只是酰基载体的不同，质体内为ACP，内质网上为辅酶A，反应每循环一次，酰

3、基链增加两个碳原子。内质网上的脂肪酸衍生途径有两条：酰基还原途径(生成一级醇、酯、可能有醛)和脱羰途径(生成醛、烃、二级醇、酮)。表皮蜡质的主要成分都由链长在20．32碳的特长链饱和脂肪酸衍生出来。脂肪酸的延伸包括4个酶促反应，它由4种酶催化；KCS，KCR，DCH、ECR。KCS催化了由丙二酰辅酶AN长链酰基辅酶A的过程，这是特长链脂肪酸合成(VLCFAs)的限速步骤，它决定了生成特长脂酰链的链长。在拟南芥中，已经研究的有四个KCS；单一缩合MFAEl，催化种子中特长链脂肪酸的合成；KCSl、FDH、CER6已被证明参与了蜡质成分的合成。盐芥与拟南

4、芥近缘，在遗传特征和生活习性上与拟南芥相似，如：小的基因组，短的生活史，都是自花授粉，有丰富的种子等：同时，相比拟南芥，盐芥又山东师范大学硕士学位论文有很多自身的优势，如更强的耐性和有更为丰富的表皮蜡质等。因此，盐芥是一种很有前景的植物蜡质研究材料。用新基因组学方法研究盐芥，可以鉴定和克隆在拟南芥中无明显性状的有价值的基因，特别是参与植物表皮蜡质合成的基因。本论文分别从植株整体发育状态、SEM观察表皮蜡质形态、GC．MS分析蜡质成分及含量方面研究了春化前后山东、Yukon、新疆三种生态型盐芥型盐芥(Thellungiellahalophita)表皮蜡

5、质的差异。结果证明春化前三种生态型盐芥没有明显的差异，叶表面光滑；4"C低温处理4周后新生莲座时和茎生叶表面都具肉眼可见白色蜡质。扫描电镜结果和C,-C．MS结果都显示低温处理后具白芒叶表面蜡质的总含量有大量增加，其中C29烷烃显著增加。SEM结果显示山东型盐芥茎生叶表皮蜡质最丰富，新疆型总含量稍低，但与山东型相差不大，Yukon型最少。蜡质成分分析与SEM结果证明特长链脂肪酸衍生物成分的增多，会引起蜡质晶体形态的明显改变，使晶体柄部增大，晶体颗粒变大。应用实时荧光定量PCR技术，我们研究了蜡质合成过程中与VLCFAs碳链延伸相关的KCS家族21个基

6、因在不同发育时期山东型盐芥中的表达，结果显示其中61．9％的基因在茎生叶中比在成熟莲座叶(16周莲座叶)中的表达量高，表明这些基因的表达与蜡质成分的生成成正相关。虽然盐芥较拟南芥表面有丰富的蜡质，但这些基因表达模式与拟南芥相仿，85％的基因与拟南芥已有的研究有相仿的表达趋势。推测可能与启动子微调或miR．NA微调有关，也可能与基因转录后修饰，如甲基化修饰有关。此21个基因在三种生态型盐芥20周茎生叶中的Real-timePCR结果显示，KCS家族中47．6％的基因在三种生态型盐芥中表达量相仿。33．3％在山东型盐芥中表达最高，其中有五个基因在山东和新

7、疆型中表达相仿，都高于Yukon中的表达。在拟南芥中，对FDH家族中的Atl907720基因未有较深的研究，本实验中用pGSAl252载体将盐芥中与Atl907720同源的基因进行基因沉默，以进一步观察其表型及用荧光定量PCR测其家族中其它基因的表达，研究同一基因家族中各基因之间的关系。关键词：植物表皮蜡质小盐芥KCS基因家族RNA沉默实时荧光定量PCR分类号；Q78Ⅱ山东师范大学硕士学位论文TheanalysisofepieutieularwaxesandtheexpessionofrelatedKCSgenesofthreeecotypesofT

8、hellungiellahalophilaAbstractWaxesfomacontinuouslipidm