第9章动物dna限制性片段长度多态性分析

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1、第9章动物DNA限制性片段长度多态性分析9.1动物DNA限制性片段长度多态性基本概况DNA限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，简称RFLP）是进行动物物种分化和群体遗传多样性研究的一项重要经典技术，而线粒体DNA和核糖体DNA则是动物RFLP研究中最为常用的两种遗传标记（Nei，Tajima1981）。动物线粒体DNA是一种共价闭环的环状双链DNA，具有严格的母系遗传方式，每个细胞中有1000～10000个拷贝，容易从组织中分离、提纯（Brown等1979；Avise等1983；Lansman1983）。提取线粒体D

2、NA的实验技术比较简单，且重复性好（王文，施立明1993）。mtDNA的基因结构比较简单、稳定，分子量小（15.7～19.5kb），处于限制性内切酶分析范围，因此易于进行结果分析（Brown1979）。在脊椎动物中，mtDNA无组织特异性，即个体内的线粒体DNA具有高度的均一性（Avise等1983），这就有利于限制性内切酶分析。更为重要的是，mtDNA进化速度快，是单拷贝核DNA的5～10倍，因而是进行近缘种间和种内群体间分化关系研究的良好遗传标记（Brown等1979，1983；Wilson1985；Avise1986；Harrison1989）。生物多样性研究中基本保护单

3、元----进化显著性单元（evolutionarysignificantunits，简称ESUs）（Ryder1989）的确定，就极大地依赖于不同动物群体线粒体DNA单倍型的系统发育关系（Moritz1994）。ESUs的定义为：在mtDNA单倍型上互为单系群（monophyly）、在核基因座位上等位基因频率有显著差别的群体即称为ESUs。强调mtDNA的互为单系群，不仅因为它在进化上的重要性，而且因为理论上和模拟实验均说明隔离群体在一定时间后能达到这种状态。生物ESUs已被证明是一个在保护中很有用的概念标准。例如，在我们最近的一项研究中，发现广西的白头叶猴（Trachypit

4、hecusfrancoisileucocephalus）和黑叶猴（T．f．francoisi）在mtDNA序列上严格地互为单系群（Wang等1996），这明确地说明了白头叶猴是保护中应受到重视的一个ESUS。核糖体DNA（ribosomalDNA，简称rDNA）是一类中等重复的核内DNA序列，每个重复单元（repetype）由非转录间隔区（non-transcribedspacer，简称NTS）、转录间隔区（internaltranscribedspacer，简称ITS）和3种RNA（18SRNA，5.8SRNA，28SRNA）基因编码区组成。这3个区域的DNA序列有不同的进化

5、速率，编码区非常保守，适合于构建生命系统树的6基部分枝；转录间隔区则中度保守，适合于推断50×10年前左右的事件；非转录间隔区则进化速度较快，适合于种间和已有隔离的群体间关系的研究（Appels，Honeycutt1986；Hillis，Davis1986；Suzuki等1990）。此外，rDNA以一种协同的方式进化，在个体内和群体内有着较好的均质性（homoplasmy）。因此，有人认为，少量个体的抽样就能有效地代表本章作者：王文，陈永久，兰宏110遗传多样性研究的原理与方法其来源群体DNA的变异情况（Dover，Coen1981；Hillis，Davis1986）。rDNA

6、重复单位的大小还正好在RFLP易于检测的范围之内（Kominami等1981；Hillis，Davis1986）。上述特点使rDNA成为动物遗传分化研究中一个有用的核内遗传标志（Hillis，Davis1986；Suzuki等1990a，1990b；兰宏等1993）。本章将介绍我们实验室常用的线粒体DNA和核糖体DNA限制性片段多态性的检测技术和数据分析方法。9.2动物线粒体DNA提取和酶切线粒体DNA（mtDNA）已被广泛用于动物群体遗传学和进化生物学的研究，并取得了令人瞩目的结果（Harrison1989）。有效的mtDNA提取方法无疑是开展这方面研究的前提。关于动物mtD

7、NA的提取，国内外已报道了不少方法。概括起来可分为：①氯化铯超速离心法（Lansman1983）；②柱层析法（赵邦悌1983）；③DNase法（俞民澍等1987）；④碱变性法（Tamura等1988；Afonso等1988）。这些方法各有其特点，也都有其局限性。我们参照Tamura等（1988）的碱变性法加以改进，建立了一种有效、快速的动物mtDNA提取方法（王文，施立明1993）。9.2.l实验材料要求用液氮长期冻存（－196℃）、或在普通冰箱冷冻室内保存（－10℃）、或放在冰壶（4℃）中