多巴胺受体在人食管下括约肌的表达及功能研究

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1、河北医科大学博士学位论文多巴胺受体在人食管下括约肌的表达及功能研究姓名：刘新波申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：刘俊峰201204中文摘要多巴胺受体在人食管下括约肌的表达及功能研究摘要人食管下括约肌(Loweresophagealsphincter,LES)是位于食管胃结合部(Esophageogastriciunction，EGJ)约2-3cm宽的特殊增厚环形肌。一般认为人LES是由胃小弯侧的半环形钩状纤维和大弯侧的斜行套索纤维所构成的。这两束肌纤维与膈肌脚一起，在LES肌源性和神经源性的因素作用下保

2、持持续性收缩的状态，最终在EGJ形成高压带，从而防止胃内容物反流入食管；而另一方面，当发生吞咽和食管扩张时，在迷走神经的抑制性通路的作用下可以引起一过性的LES舒张(Transientloweroesophagealsphincterrelaxation，TLESR)，TLESR的存在，允许了食物继续下行入胃，或形成呕吐、打嗝，从而使胃内的液体或气体反流进入食管。LES的收缩和舒张的功能调节机制是在中枢神经系统的支配下，由多种激素、神经递质及自身肌源性因素共同参与完成的。一般认为迷走神经输出神经末梢与LES肌

3、层肠道运动神经元(EntericMotorNeurons，EMN)形成突触联系，共同构成了调节LES收缩和舒张的兴奋性迷走神经通路和抑制性迷走神经通路。兴奋性迷走神经通路由节前胆碱能神经元和节后胆碱能神经元共同构成。该通路的激活可以引起LES收缩。而抑制性迷走神经通路则是由节前胆碱能神经元和节后非肾上腺非胆碱能(NonadrenergicNoncholinergic，NANC)神经元构成。激活抑制性通路可以引起LES舒张。多巴胺(Dopamine，DA)是儿茶酚胺类神经递质之一，在自主运动、认知、情感、激素调

4、节以及胃肠运动等功能的调节中发挥着重要的作用。这些功能的调节均是通过多巴胺受体(Dopaminereceptor,DAR)实现的。DAR作为含有七跨膜结构域G蛋白偶联受体家族重要的受体类型之一，广泛存在于哺乳动物的中枢及外周神经系统。到目前为止已经发现DAR共有DlR．D5R五种亚型，按照各自的结构，药理学性质以及生物学属性可以将这些受体亚型分为D1样受体(DlR、D5R)和D2样受体(D2R、D3R、D4R)。近些年的研究表明，DAR广泛地分布于动物的胃肠道之中。多种食管运动功能异常性疾病如贲门失弛缓、弥漫

5、性食管痉挛、胡桃夹食管等均与LES的运动异常有关，目前研究表明LES的调节机制涉及中文摘要多种受体，神经递质和信号转导通路。研究表明胆囊收缩素受体(Cholecystokininreceptor)，毒蕈碱受体(Muscarinicreceptor)均在LES的调节机制中发挥着重要的作用。本研究采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，蛋白印迹法(Westem。blot)，离体肌张力测定技术以及电场刺激(Electricalfieldstimulation，EFS)等方法对DAR在人LES中的表达及功能进行研究。

6、探讨了DAR在人LES调节机制中的作用，为进一步研究DA及其受体在人LES调节机制中的作用奠定基础，从而更为完善的阐述人LES调节机制，为食管运动功能障碍性疾病的临床治疗提供理论依据。第一部分多巴胺受体在人食管下括约肌的表达研究目的：DAR是G蛋白偶联受体家族重要的受体类型之一，介导着儿茶酚胺类神经递质DA所有的生理学功能。本试验采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)禾]蛋白印迹法(Western．blot)研究人LES的DAR的5种亚型在钩状纤维、套索纤维、食管和胃底的环行肌中mRNA、受体蛋白的表达规律，

7、探讨DAR在人LES的功能调节中发挥的作用。方法：选取2007年12月至2008年lO月在河北医科大学第四医院因高位食管中段癌，而行食管大部切除术的患者共30例。其中23名男性，7名女性，平均年龄64岁。手术室收集新鲜EGJ手术标本，实验室锐性剥去食管下段、贲门及胃底的粘膜及粘膜下层后，制备钩状纤维、套索纤维、食管和胃底环行肌的肌条。提取组织RNA，经紫外分光光度计和l％琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度和完整性之后，分别应用5种DAR亚型的引物行RT-PCR，检测其mRNA在4种肌条的表达，用GelPro软件分析扩增

8、产物的光密度值(IOD)，并计算DAR亚型与13．actinIOD的比值表示肌条中mRNA的相对含量。提取组织蛋白，经考马斯亮蓝G．250定量，将蛋白调整至相同浓度。然后应用电泳仪电泳，分离出与DAR各个亚型相应的受体蛋白后转膜，转膜结束后分别应用DAR各个亚型的抗体进行孵育及DAB染色，经GelPro软件分析DAB反应条带的光密度值(IOD)。结果：紫外分光度计测定显示，总RNAA260／A280