notch信号通路在t1期肾透明细胞癌转移中的作用及其机制的研究

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1、南开大学博士学位论文Notch信号通路在T1期肾透明细胞癌转移中的作用及其机制的研究姓名：艾青申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：张旭2012-05中文摘要研究背景：肾癌的致死率在泌尿系统肿瘤排名第二，约占全部肿瘤的2％。根据2009年AJCC肾癌的TNM分期，Tl期肾癌是指局限于肾脏，最大径7cm的肿瘤。大多数T1期肾癌都是局限性肿瘤，但是有少部分T1期肾癌会伴有肿瘤远处转移的症状，即T1期转移性肾癌。这部分病人往往病情凶险，肿瘤进展迅速，生存时间较短。目前临床上对于Tl期肾癌的手术治疗方

2、案尚存争论，通常对于T1期局限性肾癌一般行保留肾单位手术，而对于T1期转移性肾癌则需行根治性肾切除术。然而除了影像学证据之外，临床上还没有发现一种可以用于鉴别肾癌能否发生早期转移的分子靶标，因此少数局限性肾癌患者行保留肾单位手术后出现肿瘤进展，不得不接受二次手术治疗，并且往往预后不佳。Notch信号通路是一个在不同物种进化中相对高度保守的细胞之间信号传递的通路。在脊椎动物中，Notch受体家族包括四个成员(Notchl、Notch2、Notch3和Notch4)；Notch配体家族包括五个成员(

3、Jaggedl、Jagged2、DLLl、DLL3和DLL4)。Notch信号通路的作用包括控制细胞的分化、增殖和凋亡，它在胚胎发育和细胞命运的决定中发挥了重要的作用。有研究报道，Notch信号通路参与了肿瘤的发生发展但根据组织的不同，Notch信号通路可能发挥促癌或者抑癌的生物学作用。到目前为止，Notch信号通路在肾癌转移中的作用及其机制尚不明确。正是由于Notch信号通路在肿瘤发生发展中的重要性以及它在肾癌作用机制上的不确定性，本文作者试图通过深入的研究探寻Notch信号通路在肾癌，尤其是

4、早期肾癌的转移中发挥的具体作用，以期为临床上预防和治疗肾癌提供理论依据。方法：1、组织标本：收集中国人民解放军总医院2009年至2010年51例肾透明细胞癌组织标本，包括25例转移性肾癌、26例局限性肾癌及其配对的瘤旁非肿瘤肾皮质组织。中文摘要2、细胞培养：正常人肾近曲小管上皮细胞株HKC以及。肾透明细胞癌细胞株786一O和Caki一1。3、RNA提取和荧光定量PCR：使用总RNA提取试剂盒提取总RNA后再利用第一链反转录试剂盒逆转录为eDNA模板。荧光定量PCR采用SYBERGreen染料法比

5、较Ct值。4、蛋白提取和Westem．blot：RIPA裂解液提取组织及细胞蛋白，BCA法检测蛋白浓度，经过电泳、转膜、封闭、孵育一抗和二抗等步骤之后ECL发光检测目的条带。5、质粒构建和细胞转染：将对照空白质粒(pCMV6．Entry)、Notchl表达质粒(pCMV6．Notchl，)和Jaggedl表达质粒(pCMV6一Jaggedl)使用转染试剂转染入细胞内。6、MTS法检测细胞增殖：细胞转染后加入MTS试剂，然后用酶标仪在490nlTl波长下读取吸光值检测细胞增殖的变化。7、Trans

6、well法检测细胞迁移：将转染后细胞铺板于Transwell小室中，检测细胞迁移能力的变化。8、流式细胞仪法检测细胞周期：转染后将细胞收集、固定和染色后使用流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果：1、在HKC和786．O细胞株上，Notchl和Jaggedl在mRNA和蛋白质水平都有表达；Notchl和Jaggedl在肿瘤细胞株的表达水平高于正常肾皮质细胞株。2、肿瘤组织Notehl和Jaggedl在mRNA和蛋白质的表达水平均显著性高于瘤旁正常肾组织。Notchl在转移性肾癌中的表达水平高于局限性

7、肾癌组织；Jaggedl则相反，差异均有统计学意义。3、在不同分期的肿瘤组织中，Notchl仅在T1期转移性肾癌组织的表达显著高于局限性肾癌。Jaggedl的表达水平在各组分期中都没有显著性差异。4、T1期转移性肾癌的平均直径显著大于T1期局限性肾癌的平均直径。Notchl的表达水平和肿瘤直径呈正相关，差异有统计学意义；Jaggedl的表达与肿瘤直径没有相关性。5、Notchl和Jaggedl可以显著促进肿瘤细胞株786．O和Caki一1的增殖能力。但仅有Notchl能够促进正常肾脏上皮细胞株H

8、KC的增殖，Jaggedl则不行。II——．．中文摘要—————————————————————————————————二二=—————————一．6、Notchl和Jaggedl可以显著促进肿瘤细胞株786．O和Caki．1的迁移能力。在两株细胞株中过表达Notchl和Jaggedl之后，转移相关性基因MMP．9的mRNA表达水平显著增加。7、过表达Notchl和Jaggedl并不影响所有细胞株细胞周期的义Z_x～并且细胞周期相关基因P21和P27的mRNA表达水平没有显著性改变。结论：本研究