自体prp对钛表面成骨细胞分化的影响及tgf-β1的变化

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1、河北医科大学硕士学位论文自体PRP对钛表面成骨细胞分化的影响及TGF--β1的变化姓名：洪伟申请学位级别：硕士专业：口腔临床医学指导教师：赵云转201203中文摘要自体PRP对钛表面成骨细胞分化的影响及TGF-B1的变化．摘要目的：富血小板血浆(PRP)是口腔种植学和组织工程学一个新的应用，也是临床医师和研究者所关注的领域。它是生长因子的载体，含有大量的生长因子：如转化生长因子．131(TGF．131)、转化生长因子．p2、血小板源性生长因子．AA、血小板源性生长因子．BB、血小板源性生长因子一AB、血小板衍生血管内皮

2、细胞生长因子、胰岛素样生长因子．1等，并能影响骨的再生。TGF．131是作用最为广泛，最受关注的生长因子之一。近年来，它的最佳浓度具有较大争议。本实验通过研究不同浓度的白体PRP对体外培养钛表面成骨细胞的影响以及TGF一131浓度的变化，为今后PRP及TGF一131在口腔种植学和组织工程学的临床应用提供合理的浓度和作用时间作为参考依据。方法：1BMSCs的培养：2—3月龄的新西兰白兔麻醉后，从胫骨平台的骨髓腔处抽取骨髓4-6ml，采用全骨髓法原代培养，于37℃、5％C02和适宜湿度的培养箱内进行培养。2绘制细胞生长曲线

3、：第三代BMSCs接种于24孔培养板，培养1至10天，每日显微镜下BMSCs计数，然后绘制细胞生长曲线。3钛片的制备：将商业纯钛钛片以SiC防水砂纸600、800、1000目同方向逐级打磨至表面呈金属光泽，用线切割法将抛光钛片切割为直径为10mm，厚度为lmm的圆形小钛片，依次用丙酮、无水乙醇、75％乙醇及双蒸水分别超声清洗20分钟。4PRP的制备：PRP来自兔的全血，采用两次离心法制备。具体制备方法如下：兔麻醉后，自颈动脉处抽取所有全血约l20ml至盛有3．8％枸橼酸钠的容器内，分装后，第一次以l100r／rain的

4、速度离心l0min，吸取所有上清至红细胞界面下2-3mm；第二次再以2200r／min的速度离心10min，弃三分之二上清，所剩液体即为PRP。PRP经激活剂(10％氯化钙溶液+牛凝血酶)激活，得到富含生长因子的血清。以上所有步骤在两小时内完成。中文摘要5成骨细胞鉴定：收集第三代成骨细胞，加入成骨诱导液诱导培养，进行碱性磷酸酶和钙结节染色鉴定成骨分化能力。6实验分组：将第四代BMSCs接种于钛表面，实验组加入含10％、20％、30％PRP的完全DMEM培养液；对照组加入无血清的完全DMEM培养液；空白对照组无钛片并加入

5、无血清完全DMEM培养液。各组设三复孔。7ALP活性检测：在4、7、10、14d检测实验组和对照组ALP的含量，按照ALP试剂盒操作。8ELISA法检测TGF．p1的含量：在1、2、3、4d检测实组TGF—pl的含旦里o9钛表面细胞形态行荧光染色：在4、7、10d对实验组细胞进行F．actin染色和DAPI染色，荧光显微镜观察细胞形态的变化。结果：1BMSCs的培养：原代BMSCs细胞呈短梭形，至12d左右可达到80％融合，细胞形态为均一的梭形，突起更为明显，漩涡状排列，传代后的细胞形态比原代细胞更为均一，增殖迅速。根

6、据生长曲线图可知，传代培养潜伏期一般为2．3d，4．7d为对数生长期，8．10d增殖趋于稳定，达到平台期，细胞增殖趋于平缓。2成骨细胞的鉴定：ALP染色和钙结节染色结果呈阳性，ALP染色结果示胞浆中出现红棕色、棕褐色或咖啡色颗粒，钙结节茜素红染色染色显示橘红色钙化物，表明细胞具有成骨细胞。3PRP的测定：两步离心法制备PRP中的血小板为878+87x109／L，是全血中血小板数目的4．2倍(全血为217+43x109／L)。4ALP活性测定：在第4、7、10、14d，ALP的OD值实验组>对照组，存在显著性差异(尸

7、．05)；实验组的OD值20％PRP组>10％PRP组>30％PRP组，也存在显著性差异(P<0．01)；在第10d20％PRP实验组获得最高OD值，表明最佳浓度为20％PRP，因J比BMSCs的分化与PRP的浓度和时间有紧密的关系。5TGF．[31含量测定：根据标准曲线，PI冲中TGF—p1的值为188．358ng／ml，表明两步离心法制备的PRP经激活剂激活后可以获得高浓度的TGF．fll。前4d各实验组TGF．p1的含量比较：(1)1、2、3、4d与Od的TGF—p1含量比较：中文摘要0d

8、性差异(p