鸭坦布苏病毒巢式pcr检测方法及其重组e蛋白间接elisa诊断方法的研究

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1、山东农业大学硕士学位论文鸭坦布苏病毒巢式PCR检测方法及其重组E蛋白间接ELISA诊断方法的研究姓名：郝明飞申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：崔言顺20120612山东农业人学硕十学位论文中文摘要2010年4月以来，我国东南部分地区饲养的种鸭和蛋鸭爆发了鸭坦布苏病毒病，以产蛋急剧下降为特点，给养鸭业造成了巨大的损失，因此有必要建立一种快速、敏感、特异的诊断方法。分子生物学技术的发展为黄病毒属病毒的快速诊断带来了新的策略。参照GenBank已登录的黄病毒基因序列设计黄病毒通用引物，建立了基于黄病毒通用引物的高敏感巢式PCR检测方法，为黄病毒、特别是新发黄病毒提供了高

2、效的检测方法。该方法通过序列的比对，选择NS5基因保守区设计了两对通用简并引物FlavP1．FlavP4，在此基础上建立了巢式PCR检测方法，并应用到鸭坦布苏病毒(ducktembub'Uvirus，DTV)的检测中。该方法仅能扩增鸭坦布苏病毒目的基因而不能扩增其他病毒，且敏感性达到90个拷贝·心1，比普通PCR高出1000倍。以上结果表明，设计的黄病毒引物具有良好的敏感性和特异性，其巢式PCR敏感性高，并成功的进行了鸭坦布苏病毒的检测。同源性和进化分析表明，新发黄病毒属蚊媒黄病毒类恩塔亚病毒群，与坦布苏病毒及近期报道的鸭坦布苏病毒分离株BYD关系最近．本研究表明该检测方法

3、可以用于该病的临床诊断和流行病学调查，并阐明了鸭坦布苏病毒的进化地位。包膜蛋白(E蛋白)是黄病毒的主要结构蛋白，在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。从规模化养鸭场分离到6株鸭坦布苏病毒，并采用特异性引物成功扩增出E蛋白基因。结果表明，E基因全长1503bp，编码501个氨基酸，序列高度保守。将E基因克隆到pMDl8-T载体中，经酶切鉴定和序列测定无误后，再将该基因克隆到表达载体pET21aqa，并转化Ecoli后进行诱导表达。采用原核表达系统对E基因进行了表达，经SDS-PAGE分析，E蛋白大dx54．3kDa，主要以包涵体形式存

4、在。Westernblot分析结果表明，表达经亲和层析法纯化后的蛋白能与阳性血清发生特异性反应。亲和层析法从表达产物中纯化目的蛋白，从而为制备鸭坦布苏病毒实验室诊断抗原和分析E蛋白的基因结构与功能的关系奠定了基础。中和试验(NT)和血凝抑制试验(HI)是目前诊断黄病毒感染的最特异方法，然而中和试验耗时较长，费时费力。为建立快速检测鸭坦布苏病毒的血清学方法，以纯化的表达产物作为包被抗原，初步建立了针对E蛋白抗体的间接ELISA检测方法。对ELISA各种反应条件进行了摸索，确定了最适工作条件。优化后确定的抗原最适包被浓度为7Ilg／mL，血清的最佳稀释度为l：320，酶标抗体最

5、适稀释度为l：1000。在优化条件下，阴阳性临界值判定标准为0．3244。本研究快速检测鸭坦布苏病毒抗体问接ELISA的初步一堕丝塑苎塑耋墨苎呈￡垦鱼翌塑鲨丝些重丝旦堡皇塑堡互坐塑立塑堑型型塑翌翌————一建立为该病的检测和流行病学调查提供了新的方法·关键词：鸭坦布苏病毒；巢式PCR；包膜蛋白；间接ELISADevelopmentandapplicationofthenestedPCRassayforducktembusuvirusandRecombinantProteinindirectELISAAssayAbstractFromAprilthroughNovember2

6、010，duckinfectiousdiseasecharacterizedbyasuddenonsetcausedbyanewlyemergedflavivirusiswidelyspreadinginsoutheastChina．Itisnecessarytoestablisharapidandspecificdiagnosismethod．Thedevelopmentofmolecularbiologicaltechniqueprovidednewstrategiesforthedesignofflavivirusrapiddiagnosis．Flavivirusun

7、iversalprimerpairsandnestedPCRweredevelopedasaefficientmethodtodetectflavivirus，especiallynewtypeflavivirus．FourprimersFlayPI—FlayP4locatedinconservedregionoftheNS5geneweredesignedafteralignmentoftheflavivirusgenomeandthennestedPCRwasdevelopedassayforDTV．Neste