鸭坦布苏病毒e蛋白单克隆抗体制备及间接elisa方法建立硕士论文

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1、分类号S852.62学校代码10129UDC619学号09201077鸭坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立DevelopmentofmonoclonalantibodyagainsttheDuckTembusuvirusandEstablishmentofanindirectELISA申请人：姬希文学科门类：农学学科专业：预防兽医学研究方向：动物传染病学指导教师：张七斤教授李泽君研究员论文提交日期：二〇一二年五月摘要本研究利用RT-PCR方法扩增鸭坦布苏病毒（DTMUV）奉贤株（FX2010）

2、的结构蛋白E基因，并将其克隆至原核表达载体pET32a，构建重组表达质粒pET32a-E。将其转化受体菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导进行表达。SDS-PAGE和WesternBlot试验分析表明，E基因在大肠杆菌中得到了表达，并且可与DTMUV鸭阳性血清发生特异性反应，具备良好的抗原性。本研究利用纯化的DTMUV奉贤株（FX2010）作为包被抗原，建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA方法，并对各种检测条件进行了优化。优化后确定的抗原最适包被浓度为1.675μg/孔，抗原最佳包被条件

3、为37℃放置2h后，4℃下过夜，血清的最佳稀释度为1:200，酶标抗体最适稀释度为1:2000。在优化条件下，阴阳性临界值判定标准为0.432。结果显示，本次试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、稳定性和敏感性。本研究利用纯化的鸭坦布苏病毒奉贤株（FX2010）免疫BALB/c小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术，筛选获得3株能够稳定分泌抗DTMUV单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为：J1-E5-E4、7B5和1E5-B6，3株杂交瘤细胞经腹腔注入同品系小鼠后产生的抗体ELISA效价达到1:12800、1:6400和

4、1:25600。间接ELISA和IFA结果显示，3株单抗均可以与DTMUV发生特异性反应。进一步研究发现，J1-E5-E4可以与DTMUV-E蛋白结合，使得表达E蛋白的293T细胞显现出特异性的绿色荧光；在病毒中和试验中，J1-E5-E4可以特异性的中和DTMUV，使其失去致死鸡胚的能力。关键词：鸭坦布苏病毒；间接ELISA；E蛋白；原核表达；单克隆抗体DevelopmentofneutralizingmonoclonalantibodyagainstDuckTembusuvirusandEstablishmento

5、fanindirectELISAAbstractInthisexperiment，TheEgeneofduckTembusuvirus(DTMUV)wasamplifiedbyRT-PCRandinsertedintothemultipleclonesitesofthepET32a(+)vector.TherecombinantplasmidwastransformedintoBL21(DE3)competentcellsandthecellswereinducedwithIPTGtoexpresstheEprote

6、in.SDS-PAGEandWesternBlotassaysshowedthatheEproteinwassuccessfullyexpressedandkepttheactivityforbindingtheDTMUV-specificantibody.Inthisexperiment，AnindirectELISAwasestablishedusingpurifiedDTV(FX2010isolate)ascoatingantigen.Thereactionconditionswereoptimizedincl

7、uding1.675μg/wellcoatingantigenofpurifiedthevirus，1：200dilutionoftestingserumand1：2000dilutionofHRPconjugatedanti-duckIgGwithcutoff-valueof.0.432(OD450nm).TheresultsrevealedtheindirectELISAhasgoodstabilityandspecificity，sensitivity.Inthisexperiment，BALB/cmicewe

8、reimmunizedwiththepurifiedduckTembusuvirus(DTMUV)Fengxianstrain(FX2010).Threemonoclonalantibodies(McAb)designatedJ1-E5-E4，7B5and1E5-B6wereobtainedbylymphocytehybridomatechni