坦布苏病毒e蛋白单克隆抗体的制备

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1、坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备DevelopmentofMonoclonalAntibodiesagainstProteinEofTembusuVirus[本文受公益性行业(农业)科研专项(201003012)；江苏高校优势学科建设工程项目资助]研究生：李鑫专业：预防兽医学导师：彭大新教授陈素娟副教授刘秀梵教授扬州大学兽医学院2013年6月李鑫：坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备研究生：李鑫导师：彭大新教授陈素娟副教授刘秀梵教授摘要坦布苏病毒病是由坦布苏病毒(Tembusuvirus)引起的以鸭、鹅等产蛋下降及出血

2、性卵巢炎为特征的新出现的传染病。根据其临床及剖检症状，学者们曾提出了鸭产蛋下降综合征、鸭出血性卵巢炎、鸭病毒性脑炎、鸭鹅脑炎．卵巢炎综合征、鸭传染性产蛋减少症等名称。该病的流行给养殖业造成了巨大的损失，而目前尚没有有效的疫苗及药物控制该病的发生。E蛋白是坦布苏病毒的主要结构蛋白之一，位于成熟病毒粒子的表面，它参与病毒的吸附和穿入等过程，影响病毒毒力及细胞嗜性，能刺激机体产生中和抗体，诱导保护性免疫应答。本研究通过连续传代培养获得了能在Vero细胞上稳定传代的坦布苏病毒，成功获得了原核表达的截短E蛋白，并研制出了针对E蛋白的单克隆抗体，为进一步研究

3、E蛋白结构和功能、建立坦布苏病毒的诊断方法、研制新型疫苗奠定了基础。1．坦布苏病毒在Vero细胞上的适应性培养将鹅源坦布苏病毒SHYG株第4代无菌尿囊液接种于Vero细胞并进行连续传代，分别取第5、10、15、20、25、30、35、40和45代病毒测定其TCID50。结果显示，第l代病毒培养1周后才能观察细胞病变；传至第20代时，细胞病变时间提前到第3天；通过RT-PCR扩增E蛋白全基因鉴定，确定引起细胞病变为坦布苏病毒；TCID50测定显示第5代病毒的滴度为101．67TCID50／mL，第30代病毒的滴度为10633TCID50／mE，病毒

4、滴度呈现一个逐渐升高并稳定的过程，表明坦布苏病毒已适应Vero细胞培养。2．坦布苏病毒截短E蛋白的原核表达PCR扩增出804bp的截短E蛋白基因，插入pET-32a(+)表达载体构建重组表达质粒pET-32a-E，利用原核表达系统进行诱导表达后，得到了主要以包涵体形式存在的重组蛋白，SDS—PAGE显示，重组E蛋白大小约为48kDa。包涵体经过溶解、纯化及复性，获得了浓度为1．239mg／mL的E蛋白，将坦布苏病毒免疫小鼠所得的血清作为～抗进行Westernblot，结果表明获得的重组蛋白有良好的抗原性。扬州大学硕士学位论文II3．坦布苏病毒E蛋

5、白单克隆抗体的制备以纯化的E蛋白免疫6-8周龄BALB／c雌鼠，100p∥只，每两周免疫一次，三免后加强免疫一次，取小鼠的脾细胞与SP2／0进行细胞融合。以纯化的E蛋白作为筛选时的抗原，HIS标签蛋白作为阴性对照，采用间接ELISA方法筛选出与E蛋自反应呈阳性，与HIS蛋白反应呈阴性的孔进行亚克隆，最后获得3株针对E蛋白的单克隆抗体，分别命名为1D985、1E6C3、3G8F7。其腹水的间接ELISA效价分别为1：64000、1：32000及1：64000；亚类鉴定结果表明，1D985单抗和3G8F7单抗属于IgGl亚类，1E6C3单抗属于IgG

6、2。亚类；间接免疫荧光结果显示，3株单抗均能与感染坦布苏病毒的Vero细胞反应产生特异性绿色荧光，与感染禽流感病毒的Vero细胞反应则无荧光；Westernblot显示3株单抗均能与E蛋白反应，而不与HIS标签蛋白反应。综上所述，本研究通过连续传代的方法得到了能在Vero细胞上稳定传代的病毒，成功构建了E蛋白基因的原核表达质粒并获得纯化的有活性的重组E蛋白，研制了3株针对E蛋白的单克隆抗体。关键词：坦布苏病毒：细胞培养；E蛋白；单克隆抗体李鑫：坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制各DevelopmentofMonoclonalAntibodiesaga

7、instProteinEofm11Ir’lemDUSUVlmSM．S．candidate：XinLiAdvisor：Prof．DaxinPengAssociateProf．SujuanChenProf．XiufanLiuAbstractTembusuvirusinfectionisanewemergingdiseasecausedbyTembusuvirus，whichischaracterizedbyeggdropandhemorrhagicovarianinflammation．Attheverystart，scholarshavenamed

8、itasduckeggdropsyndrome，duckhemorrhagicovarianinflammation，duckviral