亚洲玉米螟ostrinia furnacalis幼虫酚氧化酶原激活蛋白酶cdna克隆和表达分析

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1、CloningandExpressionAnalysisofProphenoloxidaseActivatingProteinasefromLarvaeoftheAsianCornBorer,OstriniafurnacnlisGuen6e(Lepidoptera：Pyralidae)AthesisSubmittedasPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterwithMajorinAgriculturalEntomology＆PestControlInYangzhouUniversityCandidate：Huifen

2、gZhaiSupervisor：AssociateProf．CongjingFengMay,2012Yangzhou，P．R．China目录中文摘要⋯英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一3文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51昆虫体内的酚氧化酶⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52昆虫酚氧化酶激活系统的调控⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63酚氧化酶原激活蛋白酶⋯⋯⋯⋯⋯⋯84研究目的和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯lO参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．111前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1621供试昆虫⋯⋯⋯⋯⋯．¨⋯⋯⋯⋯⋯162．2主要试剂⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．162．3主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯，⋯⋯⋯⋯162．4总RNA提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1725eDNA第—链的合成⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．6PAP基因中问片断扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1727PAP基因的TRACE⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一202．8PAP基因的5'RACE⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯212．9序列的生物信息学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．28210PAP重组蛋白原核表达探索⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．30211PAP-SP重组蛋白原核表达探索⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33212PAP的酶活剥定⋯⋯⋯2．13PAP基因表达的Rea

4、ltimePCR检测⋯383结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4l31PAP基因中间片断克隆⋯4132PAP基因RACE⋯⋯⋯⋯⋯～413．3PAP全长基因的克隆⋯443．4PAP全长基因的生物信息学分．ffr⋯453．5PAP全长的原桉表达⋯⋯3．6删尸—舻，，PAP-SP2的原核表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5637PAP-SP3的原核表达38PAP原核表达产物的酶活性测定⋯⋯⋯⋯753．9PAP基因表达水平的研究⋯⋯⋯784讨论41PAP的序列及蛋白结构分析⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯引42PAP的原核表达，纯化及酰胺酶活测定⋯⋯⋯8243PAP丝氨酸蛋白酶结构域的研究⋯⋯834．4两种RACE蓑略的比较⋯

5、⋯⋯⋯⋯⋯844．5细菌注射对PAP转录水平表达的影响．．85参考文献致谢⋯⋯⋯⋯90攻读硕士学位期间发表及完成的学术论文⋯⋯94翟会锋：亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis幼虫酚氧化酶原激活蛋白酶cDNA克隆和表达分析1摘要为研究亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guen6e)幼虫体内酚氧化酶原激活蛋白酶(prophenoloxidaseactivatingproteinase，PAP)表达调控的分子机理，本研究通过RACE技术获得该基因的cDNA序列，对PAP基因序列进行了生物信息学，通过原核表达并纯化了表达产物，采用Westernblot和酶活测定进行鉴定。

6、对玉米螟幼虫进行细菌注射，通过RealtimePCR检测注射前后PAP基因在不同组织中mRNA水平上的表达变化情况。主要研究结果如下：(1)采用RT-PCR及RACE技术从亚洲玉米螟幼虫中克隆PAP基因全长eDNA序列。该基因全长1455bp，开放阅读框为1200bp，编码400个氨基酸；5’和3’非编码区分别为66bp和189bp。PAP的计算分子量约为44．8kDa，估测等电点pI为6．66。生物信息学分析表明：该基因序列中含有丝氨酸蛋白酶样结构域中保守的催化三联体，含有两个发夹结构域(Clip)，分别为位于23．70位氨基酸的结构域和153．394位氨基酸的结构域，其中153．39

7、4位氨基酸也被称为丝氨酸蛋白酶结构域(serineproteinase，SP)。PAP蛋白无跨膜结构域，无糖基化位点，N端含有信号肽，切割位点为18与19位氨基酸之间，含有19个磷酸化位点均匀分布于整个多肽链中。BlastP分析结果表明：该片段的氨基酸序列与鳞翅目烟草天蛾ManducasextaPAP3precursor、ManducasextaPAP3、ManducasextaPAP2、家蚕肋mbyxmoriPPAE、蓖麻蚕Sam