水牛早期胚胎发育蛋白质糖基化机理及转基因克隆的研究

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1、分类号S昼!垒：墨UDC博士学位论文密级公珏水牛早期胚胎发育蛋白质糖基化机理及转基因克隆的研究李楠论文答辩日期2Q12：12：Q垒学位授予日期答辩委员会主席．廑生坚数援广西大学学位论文原创性和使用授权声明／llri／liz／／／I／／4I／／lY。／／ll／／／7／H》6l／l／／l。l／／／／17l／／ll／本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与

2、我一同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电f子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全都或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：口保密，在年解密后适用授权。／蛔尔保密。(请在以上相应方框内打“√”)论文作者签名：李彳i争日期：zD仔、上万指导教师签名：似n卜乙

3、／日期∥眵止器作者联系电话：膨乃7唱了”歹电子邮箱：二彳Ina【n兜Df7三@，2‘．ca们水牛早期胚胎发育蛋白质糖基化机理及转基因克隆的研究摘要本研究主要探讨O．GlcNAc糖基化在水牛胚胎早期发育过程中的作用机理和水牛转基因克隆的相关影响因素，以便建立一套较为完善的水牛转基因克隆技术体系。具体的研究结果如下。1、建立了水牛早期胚胎O．GlcNAc糖基化蛋白和(beta-O—linkedN-glycosylation，O．GlcNAcylafion)相关基因的表达检测方法。免疫荧光染色抗体浓度优化的研究结果发现，当一抗浓度为1：

4、200，二抗浓度为l：1000时，可清晰地观察到经抗体免疫后O-GIcNAc蛋白的分布，可用于O．GIcNAc蛋白的表达情况检测分析。为建立O—GlcNAc糖基化相关基因(GFPT、OGT和OGA)的mRNA表达荧光定量PCR检测分析方法，根据NCBI中GenBank所提供的人或牛GFPT、OGT、OGA基因的CDS序列设计水牛相关基因的PCR引物，克隆得到水牛的GFPT、OGT和OGA基因CDS序列，然后根据该序列设计合成实时荧光定量PCR引物。结果显示，PCR的CDS产物无杂带，条带均一，为特异性的目的片段扩增产物；QRT-P

5、CR的熔解温度均一，熔解曲线表现为尖锐的单一峰，证实引物的有效性，说明该QRT-PCR体系可用于检测水牛早期胚胎GFPT、OGT和OGA基因的表达。2、以水牛孤雌激活(PA)、体外受精(IVF)和体细胞核移植(SCNT)早期胚胎为研究对象，研究分析了水牛早期胚胎发育过程中O—GlcNAc蛋白及相关基因(GFPT、0GT和oGA)的表达模式。免疫荧光染色结果显示，水牛PA、IⅥ7和SCNT胚胎O-GlcNAc糖基化蛋白水平呈现相似地变化趋势，即从2．细胞期开始慢慢增加，到囊胚期达到最高；其中，IVF胚胎各阶段O—GlcNAc蛋白水平

6、均显著高于SCNT和PA组(氏0．05)，而SCNT胚胎各发育阶段O—GlcNAc蛋白水平显著高于PA组(P<0．05)。QRT-PCR的检测结果发现，水牛PA、IVF和SCNT胚胎的GFPT基因mRNA表达水平呈现先升后降的变化趋势，即从2一细胞到4一Cell期表达量升至最高，然后逐渐下降，到囊胚期达到最低；其中，GFPT的表达量在IVF胚胎各时期中表达量最高，均显著高于PA和SCNT胚胎组(P<0．05)，而SCNT胚胎组在8一细胞期后GFPT的表达量显著高于PA组(火0．05)。OGT基因的mRNA表达量随着胚胎的发育逐渐增

7、加，至囊胚期达到最高；其中，IⅦ胚胎各阶段OGT的mRNA表达量均显著高于PA胚胎(氏0．05)，而在8．细胞期和桑椹胚期显著高于SCNT胚胎(户I<0．05)。OGA基因的mRNA表达量从2一细胞期到4一细胞期呈下降趋势，而后又逐渐升高，到8一细胞期表达量达到最高，而后开始下降，到囊胚期降到最低，且IⅦ各个发育时期的胚胎OGA的mRNA表达量显著高于PA胚胎(尸

8、IcN)对水牛早期胚胎发育、0一GIcNAc蛋白及相关基因表达水平的影响。当在PA、IVF和SCNT胚胎培养的0-72h添加不同浓度的GleN(0、1、2和4mmol／L)时，2mmol／L组的囊胚率均显著高于对照组(23．75％VS13．38％；