rack1在肝细胞自噬中的作用和潜在的分子机制-(5347)

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1、RACK1在肝细胞自噬中的作用和潜在的分子机制摘要背景：复杂的信号网络在细胞生长、衰老、死亡等多种生命活动中起着重要的调节作用，这些信号网络的形成是由具有一定特异性的相对少量的信号分子(即支架蛋白)来完成的。激活的蛋白激酶C受体1（RACK1，基因名Gnb2l1）就是这样的一种支架蛋白。RACK1分子量为36kDa，含有7个WD40重复序列，与G蛋白β亚基具有高同源性，在信号传导过程中可以作为锚定蛋白和穿梭蛋白以参与信号的传导或活化。大量研究表明RACK1在肝细胞癌等肿瘤的恶性生长中有着重要促进作用。而且RACK1在肝组织中高水平表达，但其在肝脏中的病理生理作用还是未知的。自噬是一个高

2、度保守的细胞固有的生命进程，这个过程中，细胞的一些多余的成分或衰老的器官被转运到溶酶体降解或者分解。以此作为机体重要的降解去路而存在。在肝脏中，自噬促进脂肪降解，有利于脂代谢稳态的维持。自噬的启动自噬的启动需要AMPK活化或mTOR活性受抑导致的ULK1活化，接着ULK1磷酸化Beclin1导致自噬起始复合体ATG14L-Beclin1-VPS34-VPS15形成，MAPK家族成员JNK对Bcl2的磷酸化促使Bcl2与Beclin1解离，也有利于自噬起始复合体形成。ClassIIIPI3KVPS34(也称为PIK3C3)激酶活性在复合物形成后升高，催化磷脂酰肌醇(PI3P)生成，招募D

3、FCP1形成Omega小体，进而ATG12-ATG5共价结合，促进膜延伸和闭合，诱导LC3B从胞浆型（LC3BI）转变为膜型（LC3BII）、促进自噬体的形成。但是自噬起始复合体的形成机制还不清楚。我们的研究发现，RACK1对自噬有促进性作用，并且参与自噬起始复合体的形成，RACK1缺失导致肝细胞脂肪堆积。这将为自噬的相关机制的研究和脂肪肝的治疗方面的探索提供一些依据。目的：在肝来源细胞中探索RACK1对自噬是否有影响；探讨RACK1预防肝细胞脂肪堆积的作用；分析RACK1影响自噬的分子机制。方法：以饥饿或mTOR抑制因子处理诱导自噬，以氯喹阻断溶酶体活性；在上述处IRACK1在肝细胞

4、自噬中的作用和潜在的分子机制理前后通过WesternBlot检测自噬相关指标LC3BII和ATG12-ATG5等的表达；透射电镜观察饥饿诱导自噬小体和脂肪滴的形成；Nilered染色分析脂肪堆积；免疫荧光分析DFCP1Opuncta的形成；激酶活性分析的方法检测VPS34活性；免疫沉淀与银染、质谱鉴定相结合寻找RACK1相互作用蛋白；利用免疫共沉淀的方法验证RACK1和自噬起始复合体ATG14L-Beclin1-VPS34-VPS15之间的相互作用；利用GST-pulldown的方法检测体外翻译的自噬起始复合体成分和RACK1的直接结合。结果：1）RACK1促进自噬并抑制肝细胞中脂肪堆

5、积在肝来源细胞系中敲低内源RACK1的表达，自噬标志物LC3BII的本底水平和饥饿诱导的LC3BII生成显著降低。RACK1敲低的情况下，mTOR抑制因子和/或氯喹作用后的LC3BII水平也降低，说明LC3BII水平下降的原因是自噬减少而不是溶酶体活性过强。F/F;Alb-CrehepWesternBlot鉴定Gnb2l1(即Gnb2l1)小鼠表明，RACK1在肝细胞F/Fhep中的表达缺失，但在其它组织中的表达与对照Gnb2l1小鼠无差异。Gnb2l1hep小鼠从生后4个月起肝脏变大、变黄；透射电镜下可见6周大Gnb2l1小鼠的肝细胞脂肪滴增多而糖原减少、线粒体数量增多但体积变

6、小；饥饿48小时后，F/FhepGnb2l1小鼠肝细胞中出现较多自噬小体，而Gnb2l1小鼠的肝细胞无自噬小体，并且线粒体膨胀、脂肪滴数量和体积增大。NileRed染色证实了脂肪的堆hep积。WesternBlot表明饥饿前后Gnb2l1小鼠肝组织LC3BII生成均减少,证实RACK1的缺失导致自噬水平的降低。2)RACK1参与自噬的早期进程LC3BII的生成依赖于ATG12-ATG5的共价结合，WesternBlot表明饥饿前hep后Gnb2l1小鼠肝组织ATG12-ATG5生成均减少,提示RACK1影响更早期的分子事件。在RACK1敲低的肝来源细胞及其对照细胞中表达GFP-D

7、FCP1，发现RACK1敲低导致DFCP1Opuncta形成的减少；并且整体VPS34激酶活性或ATG14L相关的VPS34激酶活性均在RACK1敲低或敲除的情况下降低，表明RACK1参与自噬的早期进程。3）RACK1促进自噬起始复合体的形成为了进一步揭示RACK1参与自噬的分子机制，我们在RACK1敲低的人肝来源IIRACK1在肝细胞自噬中的作用和潜在的分子机制细胞中表达GFP标签的人源RACK1分子，由于GFP-RACK1也受RNA干扰作用