抗人转铁蛋白受体单克隆抗体体外抗瘤效应探究

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1、抗人转铁蛋白受体单克隆抗体体外抗瘤效应探究摘要：目的：探讨抗人转铁蛋白受体（TfR）单克隆抗体（mAb）体外抗瘤效应。方法：采用CFSE染色、PIAnnexinV染色和PI染色，通过流式细胞术分析抗人TfRmAb对高表达的人肝癌细胞系HepG2和人乳腺癌细胞系MCF7增殖、凋亡和周期的影响；通过MTT法检测抗人TfRmAb联合化疗药物对HepG2和MCF7细胞增殖的抑制作用。结果:抗人TfRmAb能抑制HepG2和MCF7细胞的增殖，并诱导其凋亡和S期阻滞；与化疗药物联用可增强其对肿瘤细胞增殖的抑制作用。结论：抗人TfRmAb具有良好的体外抗瘤效应。关键字：转

2、铁蛋白受体单克隆抗体体外抗瘤效应转铁蛋白受体（transferrinreceptor,TfR）,即CD71分子，是细胞获得铁元素的关键性分子。由于TfR是细胞增殖所必须的，而且在快速生长的肿瘤细胞表面稳定性的高表达［1］,因而成为肿瘤生物治疗的一个相对特异性的靶点。针对TfR的治疗性抗体发展迅速，并在体内、外的抗瘤研究中取得了良好的效果。但有研究显示，不同的TfR抗体的生物学活性不尽相同［2］。我室所获得的抗人TfR单克隆抗体（mAb）可以特异性识别人肿瘤细胞表面TfR胞外端，并具有较高的亲合力，前期实验显示其对人红白血病细胞系K562具有明显的抗瘤作用［3］

3、。在此我们进一步观察抗人TfRmAb对高表达TfR的人肝癌细胞系（HepG2）和人乳腺癌细胞系（MCF7）的增殖、周期和凋亡的影响；以及与临床常用化疗药物［5氟尿口密噪（5FU）、阿霉素（ADM）］是否存在协同抗瘤作用，为临床应用研究提供实验依据。1材料和方法1.1材料抗人TfRmAb为本室所收藏的分泌抗人TfR杂交瘤细胞株，经诱生BALB/c（nu/nu）裸鼠腹水，DEAESephadexA50纯化，SDSPAGE电泳鉴定。竣基荧光素二酯酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）、碘化丙唳（PI）、四甲基偶氮13坐蓝（MTT）、二甲亚枫（DMSO）均为Sigma公司产品。

4、PIAnnexinV细胞凋亡检测试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品。5FU为浙江海正药业有限公司产品。ADM为法玛西亚有限公司产品。人肝癌细胞系HepG2和人乳腺癌细胞系MCF7均由本实验室保存。1.2方法1.2.1CFSE染色检测肿瘤细胞增殖分别收集对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞，用冰冷的PBS液洗涤2次后,调整细胞密度为5X109/L,取1mL加入1nLCFSE（终浓度为1nmol/L）置于37°C,孵育30mino加入1mL小牛血清终止染色，再用冰冷的PBS洗涤3次后接种于24孔培养板中（5X104/孔）。并预留1X106个染色后的细胞作

5、为母代细胞，40g/L多聚甲醛固定后4°C避光保存，待上机。待细胞贴壁后分别加入抗人TfRmAb至终浓度为20、40、60、80和100mg/L,每种浓度重复3孔。并设相同浓度的非特异性鼠源性IgG作为对照。作用72h后，收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤后，采用流式细胞仪FACS检测,并利用ModFitLTforMacV3.0软件进行参数获取和数据分析。1.2.2PIAnnexinV染色检测肿瘤细胞凋亡分别取对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞接种于24孔培养板中（5X104/孔），加入抗人TfRmAb至终浓度为60mg/L,重复3孔。并设相同浓度的非特

6、异性鼠源性IgG作为对照。作用72h后，收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤2次后，按PIAnnexinV细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，采用流式细胞仪FACS检测，并利用CellQuest软件进行参数获取和数据分析。1.2.3PI染色检测肿瘤细胞周期分别取对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞接种于24孔培养板（5X104/孔），加入抗人TfRmAb至终浓度为60mg/L,重复3孔。并设相同浓度的非特异性鼠源性IgG作为阴性对照。作用72h后，收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤2次后，加入预冷的700mL/L乙醇固定细胞4°Cit夜。流式检测前用PBS液洗去固

7、定液，加入0.5mL的PI综合染液（含50g/LRNA酶），避光染色30min后，采用流式细胞仪FACS检测，并利用ModFitLTforMacV3.0软件进行参数获取和数据分析。1.2.4MTT比色法检测抗人TfRmAb联合化疗药物对肿瘤细胞增殖抑制作用分别取对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞接种于96孔培养板（IX104/孔），待细胞贴壁后,根据预实验结果分别加入IC50浓度的化疗药物（5FU、ADM）和抗人TfRmAb,37°C,50mL/LC02继续培养48h后，每孔加入10uLMTT（终浓度为0.5g/L）,继续培养4h后,1000r/min离

8、心10min,弃上清，每孔加100uL