抗人转铁蛋白受体单克隆抗体体外抗瘤效应研究

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1、抗人转铁蛋白受体单克隆抗体体外抗瘤效应研究：沈昕,邢薇,何峰容,李黎,刘静,朱慧芬,雷萍,沈关心【摘要】　　目的:探讨抗人转铁蛋白受体(TfR)单克隆抗体（mAb）体外抗瘤效应。方法:采用CFSE染色、PIAnnexinⅤ染色和PI染色,通过流式细胞术分析抗人TfRmAb对高表达的人肝癌细胞系HepG2和人乳腺癌细胞系MCF7增殖、凋亡和周期的影响;通过MTT法检测抗人TfRmAb联合化疗药物对HepG2和MCF7细胞增殖的抑制作用。结果:抗人TfRmAb能抑制HepG2和MCF7细胞的增殖,并诱

2、导其凋亡和S期阻滞;与化疗药物联用可增强其对肿瘤细胞增殖的抑制作用。结论:抗人TfRmAb具有良好的体外抗瘤效应。【关键词】转铁蛋白受体单克隆抗体体外抗瘤效应　　转铁蛋白受体（transferrinreceptor,TfR）,即CD71分子,是细胞获得铁元素的关键性分子。由于TfR是细胞增殖所必须的,而且在快速生长的肿瘤细胞表面稳定性的高表达[1],因而成为肿瘤生物治疗的一个相对特异性的靶点。针对TfR的治疗性抗体发展迅速,并在体内、外的抗瘤研究中取得了良好的效果。但有研究显示,不同的TfR抗体的生物学活

3、性不尽相同[2]。我室所获得的抗人TfR单克隆抗体（mAb）可以特异性识别人肿瘤细胞表面TfR胞外端,并具有较高的亲合力,前期实验显示其对人红白血病细胞系K562具有明显的抗瘤作用[3]。在此我们进一步观察抗人TfRmAb对高表达TfR的人肝癌细胞系（HepG2）和人乳腺癌细胞系（MCF7）的增殖、周期和凋亡的影响;以及与临床常用化疗药物[5氟尿嘧啶（5FU）、阿霉素(ADM)]是否存在协同抗瘤作用,为临床应用研究提供实验依据。　　1材料和方法　　1.1材料抗人TfRmAb为本室所收藏的分泌抗人Tf

4、R杂交瘤细胞株,经诱生BALB/c（nu/nu）裸鼠腹水,DEAESephadexA50纯化,SDSPAGE电泳鉴定。羧基荧光素二酯酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）、碘化丙啶（PI）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲亚砜（DMSO）均为Sigma公司产品。PIAnnexinⅤ细胞凋亡检测试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品。5FU为浙江海正药业有限公司产品。ADM为法玛西亚有限公司产品。人肝癌细胞系HepG2和人乳腺癌细胞系MCF7均由本实验室保存。　　1.2方法　　1.2.1CFSE染色检测肿

5、瘤细胞增殖分别收集对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞,用冰冷的PBS液洗涤2次后,调整细胞密度为5×109/L,取1mL加入1μLCFSE（终浓度为1μmol/L）置于37℃,孵育30min。加入1mL小牛血清终止染色,再用冰冷的PBS洗涤3次后接种于24孔培养板中（5×104/孔）。并预留1×106个染色后的细胞作为母代细胞,40g/L多聚甲醛固定后4℃避光保存,待上机。待细胞贴壁后分别加入抗人TfRmAb至终浓度为20、40、60、80和100mg/L,每种浓度重复3孔。并设相同浓度的非特异性

6、鼠源性IgG作为对照。作用72h后,收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤后,采用流式细胞仪FACS检测,并利用ModFitLTforMacⅤ3.0软件进行参数获取和数据分析。　　1.2.2PIAnnexinⅤ染色检测肿瘤细胞凋亡分别取对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞接种于24孔培养板中（5×104/孔）,加入抗人TfRmAb至终浓度为60mg/L,重复3孔。并设相同浓度的非特异性鼠源性IgG作为对照。作用72h后,收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤2次后,按PIAnnexinⅤ细胞凋亡检测试剂

7、盒说明书操作,采用流式细胞仪FACS检测,并利用CellQuest软件进行参数获取和数据分析。　　1.2.3PI染色检测肿瘤细胞周期分别取对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞接种于24孔培养板（5×104/孔）,加入抗人TfRmAb至终浓度为60mg/L,重复3孔。并设相同浓度的非特异性鼠源性IgG作为阴性对照。作用72h后,收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤2次后,加入预冷的700mL/L乙醇固定细胞4℃过夜。流式检测前用PBS液洗去固定液,加入0.5mL的PI综合染液（含50g/LRNA酶）,避

8、光染色30min后,采用流式细胞仪FACS检测,并利用ModFitLTforMacⅤ3.0软件进行参数获取和数据分析。　　1.2.4MTT比色法检测抗人TfRmAb联合化疗药物对肿瘤细胞增殖抑制作用分别取对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞接种于96孔培养板（1×104/孔）,待细胞贴壁后,根据预实验结果分别加入IC50浓度的化疗药物（5FU、ADM）和抗人TfRmAb,37℃,50mL/LCO2继续培养48h后,每孔