白念珠菌耐药相关蛋白rta2p与脂筏关系研究

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1、第二军医大学博士学位论文白念珠菌耐药相关蛋白Rta2p与脂筏关系研究姓名：王琳申请学位级别：博士专业：药理学指导教师：姜远英201205白念珠茵耐药相关蛋白Rta2p与脂筏关系研究摘要白念珠菌(C口玎诫妇口场觇眦)是目前深部真菌感染最为普遍的病原菌之一，目前治疗白念珠菌感染临床应用较多的是唑类药物，随着长期大量广泛地应用，耐药菌株不断产生，由耐药导致的治疗失败越来越多。因此，需要我们寻找白念珠菌对唑类药物的耐药机制，为药物治疗提供依据。在白念珠菌中，脂筏(1ipidms)也叫做去垢剂不溶膜(detergent．resist锄tmembr觚es，DItMs)，是细胞膜上

2、富含麦角甾醇和鞘脂的区域，其中还包含许多具有重要功能的蛋白，在许多细胞活动中发挥重要的作用。我们实验室前期的研究发现，在白念珠菌中，R尉2是钙调神经磷酸酶介导的唑类药物耐药的必须基因，并且Rta2p参与了鞘脂成分一长链碱二氢鞘氨醇从细胞膜内向细胞膜外转运。因此，我们推测Rta2p可能是通过影响脂筏发挥对唑类药物的耐药作用。在本实验中，我们构建了Rta2p．GFP的融合表达菌，通过激光共聚焦显微镜观察，发现Rta2p可以和脂筏的主要组成成分麦角甾醇共定位，且这种定位会被麦角甾醇和鞘脂合成通路的抑制剂破坏。接着我们用加入去垢剂嘶torl)(．100的密度梯度超速离心方法提

3、取脂筏，利用Wbstemblot方法考察分离的脂筏，发现Rta2p与公认的脂筏的标志性蛋白(Pmalp觚dGaSlp同源蛋白)都定位在脂筏区域，而这种定位也会被麦角甾醇和鞘脂合成通路的抑制剂破坏。为了研究R刚2缺失对脂筏的影响，我们首先通过气一质联用的方法测定了亲本菌，缺失菌的总甾醇含量，及脂筏区，非筏区麦角甾醇的百分含量，用Filipin染色观察麦角甾醇分布，结果显示，两株菌之间都没有显著差异，说明尺尉2缺失并不影响麦角甾醇的总含量，在脂筏区的含量和分布。我们又用蛋白质组学和W．estemb10t方法发现R比p主要影响lO个脂筏区域蛋白在脂筏区域的分布。其中，有5个

4、蛋白(Pmalp，G弱lp同源蛋白，E唱llp，Pmt2p和Alilp)已经被报道存在于脂筏区域，而且其中的E唱11p还是白念珠菌中众所周知的唑类药物的靶蛋白。总而言之，我们的结果说明Rta2p主要定位在脂筏区域，而且会影响脂筏区域某些特定蛋白的锚定，其在脂筏分布还会被麦角甾醇和鞘脂合成通路的抑制剂破坏。不同于常见的唑类药物的作用机制，咪康唑除了能够抑制麦角甾醇合成通路外，还能诱导活性氧(ROS)3在细胞内累积，导致真菌细胞死亡，在这之前，还会诱导细胞骨架肌动蛋白的聚集。有研究发现在酿酒酵母中，脂筏在咪康唑发挥抗真菌活性的过程中十分重要。我们想要考察在白念珠菌中是否有

5、相同的机制，以及尺刚2缺失是否会影响咪康唑的抗真菌活性。在本实验中，我们首先通过点板实验(Spot嬲say)发现，在白念珠菌中尺翻2缺第二军医大学博士学位论文失不会影响白念珠菌对咪康唑的敏感性。接着我们在野生型白念珠菌中考察脂筏抑制剂对(1)测定咪康唑抗真菌活性(2)咪康唑诱导的活性氧累积量(3)咪康唑诱导的肌动蛋白聚集的影响，发现用麦角甾醇或者鞘脂合成通路抑制剂(甲基p环糊精或依地福新)破坏脂筏会抵抗咪康唑的抗真菌活性，以及其诱导的活性氧累积和肌动蛋白聚集。为了探索Rta2p是否参与了咪康唑这一抗真菌活性机制，我们同时对尺刚2缺失菌(，．胁24仞)做了与野生菌相同的

6、实验。我们发现在单用咪康唑的情况下，R刚2缺失菌和亲本菌的生存率，活性氧累积量以及肌动蛋白聚集情况都没有显著差别。但在同时加入脂筏抑制剂(甲基B环糊精或依地福新)后，R尉2缺失能够与脂筏抑制剂协同抑制咪康唑发挥抗真菌作用。综上所述，Rta2p是一个脂筏区蛋白，能够通过影响某些脂筏区蛋白分布发挥作用。还能与脂筏抑制剂协同抑制咪康唑发挥抗真菌活性。．关键词：白念珠菌，脂筏，Rta2p，咪康唑一2·白念珠茵耐药相关蛋白Rta2p与脂筏关系研究AbStractCalldidaalbic锄s(C口舾fc口，砷iscllrrentlyoneoftllemostcommonpath

7、ogensofSystemic胁galinfection．Azoledrllgsarcmostcommordyusedintheclinicaltre咖emofC扔记讲擒iⅢbctions．WitlltIlelongtemandexcessiVeuseof戤∞Ies，dmg—resist枷s砌nswereconstalltlyproduced趾dledt0agr0、析ngnumberof仃e咖entfailure．Therefore，lool【ingfor鹏wmecll￡mismsof北oleresistanceinC扔矗∞瑚t0proVidt11e