moo诱导的notch信号系统与pten在huvec中调控机制研究

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1、郑州大学硕士学位论文MOO诱导的Notch信号系统与PTEN在HUVEC中调控机制研究姓名：徐君玲申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：冯国清201205中文摘要MOO诱导的Notch信号系统与PTEN在HUVEC中调控机制研究．研究生徐君玲导师冯国清教授郑州大学基础医学院药理教研室河南郑州450001摘要背景与目的：我国每年死于冠心病人数达100多万，缺血心肌的血管新生问题是目前心血管临床急待解决的问题。导师组近年来致力于巴戟天糖链(morindaofficinalisoligosaczhaddes，MOO)对缺血心肌的保护及血管新生作

2、用研究。以往对MOO研究发现：MOO可以显著缩小心肌梗死面积，提高缺血心肌微血管密度，明显的减轻缺氧复氧或缺血／再灌注对心肌的损伤，促进鸡胚绒毛尿囊血管生成，显著诱导血管新生过程中VEGF蛋白、bFGF蛋白、Fit-1蛋白及PDGF．B蛋白的表达。在巴戟天糖链的促血管新生的分子机制方面，导师组以缺氧复氧人脐静脉内皮细胞(}玎叫EC)为研究对象，证实了MOO可以促进HITVEC细胞增殖，迁移及促进管腔形成。导师组基因芯片研究结果发现，缺血心肌中存在Notch信号通路和PTEN的参与，但其具体机制尚不明确。因此，本实验将继续采用HUVEC细胞为

3、研究对象，探讨Notch信号通路阻断前后，对细胞增殖和细胞周期的影响，及检测MOO诱导下，对Notch信号通路各基因和PTEN的mRNA表达及蛋白变化，进一步探讨MOO在缺血心肌中的分子作用机制，及其诱导下Notch信号通路与PTEN的调控机制，为其在缺血心肌保护方面提供依据。中文摘要方法：1．建立内皮细胞体外缺氧复氧损伤(H瓜)模型：取第3代对数生长期的HUVEC细胞，制成单细胞悬液，以适宜细胞密度接种于T-25培养瓶或相应的孔板中，培养24h。弃去原有培养基，PBS洗2遍，缺氧液预先用高纯氮气饱和，37℃缺氧lh；弃去缺氧液，PBS洗2

4、遍，加入复氧液，37℃复氧2h。模型后细胞用于后续试验。2．检测HUVEC细胞中Notehl、JAGl、DLL4、HESl、PTEN和GAPDH基因表达：收获正常组和缺氧复氧组HUVEC细胞，提取总RNA，反转录eDNA，Q．PCR检测各基因表达量及相对变化。3．MTT检测D_APT对H／RHUVEC细胞增殖的影响：HUVEC单细胞悬液以lX104／gin2的浓度种于含有l、10、509mol／LDAPT或含有0．1％(v／v)DMSO的10％胎牛血清的RPMll640培养液的96孑L板中，共4组，每组设置6个复孔。培养24h后构建内皮细胞

5、体外缺氧复氧损伤(胍)模型后，继续用含DAPT或DMSO培养基培养72h后，采用MTr法检测。4．流式细胞仪检测DAPT对H／RHUVEC的细胞周期影响：HUVEC单细胞悬液以2X105／瓶的细胞密度接种于T-25培养瓶中，按上述方法造模给药，72h后，流式细胞仪检测细胞周期。：5．检测各组NotCh通路及PTEN的mRNA相对变化：HUVEC单细胞悬液以5x106的细胞密度接种于T-25培养瓶中，培养24h。分为四组，正常组、模型组、MOO组、MOO组+DAPT组。建立缺氧复氧模型，进行无血清培养48h后，收获细胞，提取总RNA，反转录e

6、DNA，采用ABI7500FastPCR仪，以GAPDH为内参，依据2以△c‘相对定量法测定mRNA变化。6．Immunoeytochernical检测Notehl蛋白及PTEN蛋白：处理后的盖玻片平铺于六孔板中，以5xIoS／：孔的细胞密度接种，细胞铺满约80％左右，做缺氧复氧模型，分为五组给药，分别为正常对照组，模型组，MOO组，MOO+DAPT组，阴性对照组。继续培养48h后，做免疫细胞化学，拍照，分析结果。7．计量资料数据采用均数±标准差(X±s)表示，采用统计学软件SPSSl8．0进行方差齐性检验、单因素方差分析，组间用LSD法进

7、行两两比较，取网．05作为检验水准。．Ⅱ．中文摘要结果：1．Q．PCR检测基因表达结果：HUVEC细胞中Notchl、JAGl、DLIA、HESl、PTEN基因均有表达，缺氧复氧损伤后Notchl、JAGl、DLL4、HESI明显上调(正O．05)。2．MTT、FCM检测结果显示：10、50I-tmol／L的DAPT对HUVEC增殖有促进作用(刚．05)，低浓度1Itmol／LDAPT促进作用不明显(矿O．05)。1、10、501xmol／LDAPT对缺氧复氧HUVEC细胞周期没有显著影响(矿O．05)。3．Q．PCR检测基因相对定量结果：

8、Q．PCR检测mRNA表达，与模型组相比，MOO组Notehl、DLL4、HESl基因mRNA低表达(胙O．05)，PTEN基因mRNA低表达(萨O．05)。DAPT阻断Notc