基于microrna鼻咽癌基因治疗初步的研究

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1、中南大学博士学位论文中文摘要摘要鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma，NPC)是我国南方常见的恶性肿瘤之一，在头颈部恶性肿瘤中占首位。鼻咽癌原发部位隐蔽，不易观察，且与鼻腔、鼻窦和颅内相毗邻，所以临床症状出现较晚而且各异；鼻咽癌也是头颈肿瘤中转移率最高的。这些都导致了鼻咽癌常常容易被误诊或漏诊，影响治疗效果。鼻咽癌的发病人群以40～50岁的青壮年多见，一旦发病对社会、经济和家庭造成较大影响。因此，鼻咽癌的早期诊断和治疗的研究一直是我国耳鼻咽喉一头颈外科学研究的重点之一。目前鼻咽癌的治疗还是以放射治疗为主。对放疗不敏感、放疗后复发以及中晚

2、期的患者，可采取化学药物治疗，但这只是辅助性治疗或姑息性治疗。鼻咽癌的手术治疗也只在一些特殊情况下作为辅助方法采用。除了以上三种常规治疗，近年来也有作者尝试应用光动力疗法和微波热疗治疗鼻咽癌，但也只能作为辅助手段。重组DNA技术的发展使肿瘤的基因治疗成为可能。根据肿瘤发生机理制定的基因治疗方案已成为肿瘤治疗的热点。早期研究者主要运用反义核酸技术干预肿瘤相关基因的表达，取得了一定效果。近年来，RNA干扰技术在哺乳动物体内的应用，更为肿瘤的基因治疗开辟了一个新的视野。目前应用于肿瘤基因治疗的RNA干扰技术大多是以非编码的小干扰RNA(siRNA)为效应分子。

3、对另一种非编码RNA----microRNA(miRNA)的应用研究才刚刚起步。miRNA是机体内源性的RNA干扰触发器，它们IV中南大学博士学位论文中文摘要可以通过在经典的RNA干扰途径降解靶基因mRNA、也可以直接抑制靶基因的蛋白翻译、还可以通过快速脱腺苷化降解mRNA。miRNA已经被看作生物体内固有的基因调控子中最大的一个家族。本研究的目的是模拟天然miRNA构建表达miRNA前体的质粒，实现调控肿瘤相关基因——人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因和血管内皮生长因子(VEGF)基因的表达，开展对鼻咽癌的基因治疗研究。整个研究内容分三部分进行：第一部

4、分调控目标基因的miRNA表达质粒的构建和有效质粒筛选。目的是确定针对hTERT和VEGF基因的miRNA的有效作用位点，观察构建的候选质粒对鼻咽癌中两个靶基因的调控效应，为后续的体外和体内实验奠定基础。结果针对l肥RT和ⅦGF基因分别构建了3个质粒，每个基因各筛选出了1个有效质粒，分别是：pcDNA6．2．GW／EmGFP．miR-hT2035、pcDNA6．2．GW／EmGFP-miR-V1025；并确定了2035～2055为hTERT的有效作用位点，1025～1045为VEGF基因的有效作用位点；将两个有效质粒瞬时转染CNE-2细胞后，应用实时荧光

5、定量RT-PCR观察到miRNA使h1ERT和VEGF基因的mRNA水平分别下调为77．3％和79．3％；应用Westernblotting观察到两个基因的蛋白表达分别下调73．2％和80．2％；应用CCK-8细胞增殖抑制实验和流式细胞术发现：miRNA对hTERT基因的调控还可以使肿瘤细胞增殖受到抑制，最高抑制率可达到51．1％，细胞周期受阻于Go-q3l期，诱导肿瘤细胞凋亡。第二部分观察调控hTERT和VEGF的miRNA表达质粒对CNE一2细胞的抑制作用。首先利用第一部分筛选出的两个有效的miRNA重组质V中南大学博士学位论文中文摘要粒，构建了能够

6、同时调控hTERT和VEGF两个基因的质粒，即I，cDNA6．2·GW／EmGFP—miR-hTERT-VEGF。将该质粒和第一部分获得的两个质粒以及阴性质粒分别转染CNE．2细胞株，经抗生素筛选后成功建立4种稳定表达miRNA质粒的CNE．2细胞株。应用实时荧光定量RT-PCR和Westernblotting观测到调控hTERT表达的质粒和同时调控两个基因的质粒分别下调hTERT的mRNA达87．6％和89．1％，下调蛋白水平达89．4％和80．5％；观测到调控VEGF的质粒和同时调控两个基因的质粒分别下调VEGF的mRNA水平达83．7％和87．5％

7、，下调蛋白水平达87．7％和81．6％。软琼脂集落实验证实靶向hTERT的质粒和同时靶向两个基因的质粒都能够抑制CNE．2细胞的集落形成能力。第三部分裸鼠体内实验。将第二部分获得的4种稳定表达具有调控作用的miRNA质粒的CNE．2细胞株和野生型CNE．2细胞株，分别注入裸鼠皮下，成功建立了人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型。通过绘制肿瘤生长曲线、计算肿瘤抑制率以及免疫组化等方法，观察体内实验的效果。结果发现调控hTERT、VEGF和同时调控两个基因的3种质粒对裸鼠移植瘤生长抑制率分别为64．8％、68．3％、69．2％。本研究最后得到以下结论：(1)成功构建了调控

8、hTERT和VEGF基因表达的microRNA质粒载体，并筛选出有效下调目标基因