重组毒株tat基因变异及对功能影响的研究

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1、温州医学院硕士学位论文论文题目：毯国塾隧堇￡壁EQZ．旦g逋征重组壹挂绝￡基国变是拯盟功篚夏响数婴究答辩委员会主席：答辩委员会成员：沈霞教授楼永良教授李伟副教授论文答辩日期：2010年5月20日’—V+～气●▲_舀温州医学院硕士学位论文目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯lAbstract．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5第一部分材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．101．研究对象和实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1

2、01．1．研究对象⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．2．菌种及质粒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1l1．3．主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯．．1l1．4．主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．111．5．细胞系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯．一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．：⋯⋯⋯132．1．血浆病毒RNA提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132．2．逆转录及巢式PCR第一轮反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．3．巢式PCR第二轮反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．142．4．琼

3、脂糖凝胶电泳⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．5．PCR产物鉴定和凝胶成像⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．162．6．产物鉴定和纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．172．7．PCR产物直接测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯：⋯⋯⋯⋯．．182．8．序列拼接、清理和序列比对⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．9．系统进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．10．序列多态性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．‘⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．11．共享序列生成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．12．遗传多样性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．192．

4、13．重组断点分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．14．感受态细胞的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．192．15．质粒的转化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．202．16．质粒的小量提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．202．17．Tat真核表达质粒的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．202．18．PCR引入突变位点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2l2．19．不同亚型tat第一外显子区感染性克隆的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．252．20．质粒的大量提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．262．21．PBMCs分离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．272．22．HIV病毒分离和培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯272．23．293一T细胞转染实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．282．24．转染上清p24检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．282．25．TZM细胞感染实验．。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．292．26．PBMC感染实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．29第二部分结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯311．tat基因特征和变异趋势分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯311．1．tat基因第一外显子扩增结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3l1．2．

6、测序结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．311．3．系统进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32～◆，●气●0q，’垤温州医学院硕士学位论文1．4．序列多态性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．321．5．同义突变和非同义突变⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．321．6．基因距离分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯351．7．特征性氨基酸分析⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．351．8．碱性区氨基酸多态性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．361．9．重组断点扫描⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯361．10．CRF07一BC重组毒株t

7、at基因变异趋势⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯381．11．CTL表位分布分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．392．质粒构建结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．412．1．Tat真核表达质粒鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．412．2．Tat真核表达质粒定点突变鉴定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．412．3．感染性克隆突变PCR及鉴定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．422．4．不同亚型tat基因第一外显子区感染性克隆的构建⋯⋯⋯⋯⋯．433．细胞学试验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯433．1．细胞转染实验⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

8、⋯．433．2．不同突变位点CBJB39N28感染性克隆的活性比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯443．3．不同突变Tat蛋白的反式激活活性的比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯463．4．不同亚型Tat蛋白CBJB39N28感染性克隆的活性比较⋯⋯⋯⋯．．48第三部