富血小板血浆prp对肌腱干细胞生物学影响的研究

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1、博士学位论文富血小板血浆(PRP)对肌腱干细胞生物学影响的研究博士研究生：杨运发指导老师：徐达传教授摘要肌腱病(Tendinopathy)的发病率极高，是骨科、运动医学、康复医学、职业病防治和老年医学的常见疾病。肌腱病严重影响人们的工作与生活，特别影响运动员竞技水平的发挥，常迫使优秀运动员提早退役。肌腱病的主要临床表现为肌腱或肌腱．骨胳连接处的疼痛、压痛甚至断裂、关节活动度受限。肌腱腱病最常见的发病部位依次为髌腱、跟腱、冈上肌腱肩袖、指深屈肌腱及肱骨外上髁伸肌总腱止点。足底筋膜炎、跟腱炎、髌腱炎、网球肘、高尔夫肘、冈上肌腱炎都是肌腱病。虽然肌腱病如此常见，其发病机制仍不

2、清楚，常认为与肌腱韧带的急慢性损伤有关。新近发现的肌腱干／祖细胞(Tendonstem／progenitorcells，TSPCs)，也称为肌腱干细胞(tendonstemcells，TSCs)或肌腱源性干细胞(tendon．derivedstemcells，TDSCs)，经传代培养后可直接成为腱细胞，具有成体干细胞的自我复制和诱导成脂、成软骨、成骨分化的潜能，是腱细胞的前体细胞。研究表明，TSCs参与肌腱的急慢性损伤修复，是肌腱急慢性损伤修复过程中的关键效用细胞。不同剂量的反复循环机械应力刺激可影响肌腱干细胞力学生物学行为，进一步导致肌腱内环境的稳态和肌腱病的发生。应

3、用体外循环机械牵伸系统模拟细胞在体反复机械应力状态，证明4％的机械拉伸能增加TSCs增殖、促进TSCs成为腱细胞，然而8％的机械拉伸可诱导TSCs分化为脂肪、软骨和骨细胞。可见，小的机械拉摘要伸(有序和适度的体育锻炼)可促进TSCs增殖并成为腱细胞，有利于肌腱的强壮及肌腱的健康；而持续较大的机械负荷(如过度劳损)是有害的，它促使肌腱干细胞分化为非腱细胞，导致脂肪堆积、黏液形成和肌腱钙化，表现为肌腱病的典型病理变化。可见，TSCs可能是探索肌腱病的突破口。因为对肌腱病还没有本质认识，临床治疗还往往是经验性的。治疗方法包括：局部制动休息、减负训练、按摩冷疗、离心型运动、口服

4、非甾体类抗炎药物、局部注射富血小板血浆(platelet．richplasma，PRP)、细胞疗法、体外冲击波术、严重时可给予糖皮质激素等治疗。对于保守治疗无效、临床症状持续较重者，可给予外科手术治疗。在这些治疗方法中，PRP局部注射具有自体来源、制作简单、可制作成凝胶状、临床使用安全、方便、经济等优点，倍受医生和患者的欢迎。因此，临床应用PI冲局部注射治疗“肌腱病”值得我们关注。PRP是全血经过梯度离心分离获得的、含有超过基线水平的浓缩血小板血浆。一般而言，血小板含量至少要达到正常血的3．5倍才能称之为PRP。当PRP被激活后，其血小板释放出大量的生长因子，包括血小板

5、衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子p(TGF．p)，血管内皮细胞生长因子(VEGF)，纤维生长因子(FGF)，内皮细胞生长因子(EGF)，血小板衍生内皮细胞生长因子(PDEGF)，胰岛素样生长因子(IGF)等。这些生长因子对细胞的增殖和分化有着重要的作用，能够刺激损伤组织血管神经化、为细胞修复或再生损伤组织提供血供和营养。体外研究已经发现PRP能促进TSCs增殖和成腱细胞形成，动物实验研究也已证实这一结果，一些临床试验也已经验证PRP能够促进肌腱和韧带急慢性损伤的愈合和有效治疗肌腱病。然而，PRP局部注射治疗肌腱和韧带的急慢性损伤和肌腱病并不总是令人满意，有一些临床

6、试验却发现PRP对肌腱和韧带急慢性损伤的修复和肌腱病的治疗无益。因此，应用PRP治疗肌腱病仍需进一步基础与临床研究。我们知道，临床应用的PRP是个体化准备的，没有明确的定义。因而，每一个人的PRP都可能不一样，并且在某些情况下，有些病人不能成功获得PRP。仔细分析PRP的制备过程及其组成成份，我们发现只有两类(共有4种)不同的Tl博士学位论文PI冲在临床使用；其中一类含白细胞(L．PRP和L．PRF)，另一类不含白细胞(P-PI冲、P-PRF)。有研究发现应用富含白细胞的PI冲有较乏白细胞的PRP更为严重的急性炎症反应。因为TSCs是肌腱急慢性损伤修复的关键效用细胞，我

7、们假设L-PRP不利于肌腱和韧带的愈合是因为L．PI冲会抑制TSCs的正常活性。本课题为证实上述假设共分为3章，即肌腱干细胞的分离、培养和鉴定；P—PRP和L．PRP的制备和鉴定；P．PRP和L．PRP对TSCs增殖、分化和细胞力学的影响。研究目的是为临床合理应用Pl冲局部注射治疗肌腱病提供理论依据。第一章兔肌腱干细胞的分离、培养及鉴定目的：分离和鉴定兔肌腱干细胞(TSCs)并评估其干细胞特性为下一步实验做准备。研究内容包括：(1)TSCs的分离及培养；(2)TSCs的克隆形成能力及增殖能力检测：(3)TSCs的流式细胞仪及免疫荧光鉴定；