产莽草酸枯草芽孢胞杆菌代谢工程改造与代谢流的分析

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1、UniVerSityOfSCienCeandTbChnOlOgVOfChinaV，AdiSSertatiOnfOrdOCtOr’SdegreeMetabO¨CengineeringandfIUXaSSayOfB-S￡，6舶f6rShikimiCaCidprOdUCtiOnAuthor’sName：DongfengLiuSpeciality：Biochemist巧andMolecularBiologySupervisor：Prof．Shuan自iangLiuFinishedtime：May1加，2014

2、㈣9川4㈨2㈣0㈣9洲5⋯2眦Y中国科学技术大学学位论文原创性声明本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。除己特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：擀签字日期：弘f哆莎．f。中国科学技术大学学位论文授权使用声明作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子

3、版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入《中国学位论文全文数据库》等有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。d公开口保密(——年)作者签名：』：f矬签字日期：沙f甲‘．，，导师签名：主l立塞!：导师签名：左l立塞!签字日期：砭[生：鱼：!三摘要以莽草酸为原料可以通过化学合成或微生物合成法生产抗禽流感病毒药物一GS4104(达菲)。莽草酸也是生物代谢途径中重要的中间体，是合成许多生物

4、碱以及芳香氨基酸(L．Phe，L．T印和L．Tyr)的原料。作为一个商业产品，莽草酸主要从八角茴香中提取。然而，利用微生物发酵方法生产莽草酸受到越来越多的关注。起始于PEP和E4P，莽草酸通过莽草酸途径的前四步反应合成而来。对于微生物生长来说，莽草酸途径是必须的，目前仍然没有关于微生物自然累积莽草酸的报道。目前，利用微生物生产莽草酸的工作主要集中在大肠杆菌，而利用枯草芽孢杆菌生产莽草酸鲜有报道。关于高产莽草酸菌株的代谢流工作前人没有开展。本研究中，我们利用代谢工程的方法对枯草芽孢杆菌进行改造并测定了莽

5、草酸高产菌株的代谢流分布。B．s“施凰1A474的莽草酸激酶基因(口，．加有一个位点发生突变，积累1．5g／L的莽草酸；B．s如ff胁1A229的EPSP合成酶基因(口，D日有一个位点发生突变，积累0．6g／L的莽草酸。在B．s砌ff凰1A474中分别单独过表达口r卅，口，．柏，口，．DC或甜DD，结果表明过表达口，DD莽草酸产量增长最多；在B．J砌ff凰1A229中分别单独过表达口剃，∥DB，口mC，口rDD或口，以，结果表明过表达口r鲥莽草酸产量增长最多。在B．s“施加1A47407或B．s材6，

6、f胁1A22911中同时过表达口r甜和口阳D，莽草酸产量最高，分别为3．2∥L或1．5g／L。B．s“施胁BSSA47407被用于下⋯一步研究。蔗糖为其最适碳源；最适蔗糖初始浓度为80∥L；B．s“施凰BSSA47407批式补料发酵莽草酸产量达到17．8g／L，其值为普通摇瓶发酵莽草酸产量的5．6倍。13C代谢流分析菌株BSSA474a和BSSA47407揭示以下结果：从葡萄糖到莽草酸途径的流量由BSSA474a中的4．4％增加到BSSA47407中的6．8％；从葡萄糖到莽草酸的流量由BSSA474a

7、中的1．9％增加到BSSA47407中的4．6％；从葡萄糖到3．脱氢莽草酸的流量由BSSA474a中的2．5％减小到BSSA47407中的2．2％；经过TCA循环的流量减小；而通过磷酸戊糖途径和糖酵解途径的流量变化不大。基于代谢流量结果，两个代谢改造目标被提出。实验结果表明：敲除矽y脯加了莽草酸产量，而过表达如并没有增加莽草酸产量。本研究利用SLIC的方法一次将口加D，口加B，口刚和硼个基因连接到质粒pHCMC04上。B．s“6ff胁BSSA47416莽草酸产量达到4．35g／L，其值为对照菌株B．s

8、砌饼括BSSA47407莽草酸产量的1．4倍。关键词：莽草酸生产；莽草酸途径：B．s动ff胁：代谢流分析：a，．卅；以，．DD；砌；舭；SLIC。摘要IIAbstractShikimicacid(SA)isakeyc11iralstaningmoleculeforthesynthesisoftheneur锄idasei11llibitorGS4104againstviralinnuenZa．Itisakeymetabolicintenllediateof