黄孢原毛平革菌胞外低分子物质在木素降解过程中作用的研究

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1、山东大学博士学位论文黄孢原毛平革菌胞外低分子物质在木素降解过程中作用的研究摘要木素是自然界中含量最丰富的可再生性有机资源之一，其生物降解构成自然界碳素循环的限速步骤。真菌中的白腐菌类具有完整的木素降解体系，能将木素彻底氧化性降解为C02和H20。黄孢原毛平革菌(Phanerochetechrysosporium)作为一模式菌株，得到深入研究。木素过氧化物酶(1igninperoxidase，LiP)和锰过氧化物酶(manganeseperoxidase，MnP)就是最早从此菌中发现的，并由此作为一个新的起点，推动

2、了白腐菌酶学领域的深入发展。但由于木素结构复杂，至今其生物降解机制仍未阐明，各类木素降解酶在胞外都难以实现对天然木素的彻底降解；免疫标记研究证明，LiP和MllP等大分子酶蛋白并不能直接穿过完整木材的微孔结构，进入细胞壁以启动木素的降解。这些研究对己发现的木素降解酶在天然木素降解中的作用提出了疑问，并启发人们推测可能有多种低分子活性物质和木素降解酶协同参与木素生物降解，因而活性低分子物质在木素、纤维素降解中的作用成为一个新的研究热点。目前发现的参与木素降解的低分子物质除02和I-1202外，主要有羟基自由基／铁离

3、子、活性氧基(reactiveoxygenspecies，ROS)、藜芦醇(veratrylalcohol，VA)、草酸等小分子有机酸，锰离子、3．羟基邻氨基苯甲酸(3-hydroxyanthranilicacid，3-HAA)等，但迄今为止，关于它们在木素生物降解过程中的作用都是推测。早在1996年，本实验室即发现木霉中的低分子肽类具有氧化性降解纤维素的能力，此后由褐腐真菌中分离纯化到具有类似功能的小肽Gtfactor，本研究工作是上述工作的深入。本论文以只chrysosprium胞外培养液中分子量5000Da

4、以下的低分子系统为研究对象，细致而全面地考察了Pchrysosprium胞外低分子系统的性质，通过一系列分离纯化步骤，从其中获得三种新型低分子量物质，分别命名为Pefactor(Pc因子)、Pcreducer‘(Pc还原因子)和MnPpromoter(MnP促进因子)。这三种低分子物质功能各具特色，Pcfactor具有酚氧化活性，Pcreducer具有还原某些自由基的性质，MnPpromoter则具有促进MnP活力的功能，采用紫外可见光谱(UV-Vis)、红外光谱(FT_IR)、质谱(Ms)、核磁共振(NMR)、

5、电子自旋共振(ESR)等方法探索了其结构与性质，研究了它们在木素生物降解中的作用，并进一步做了组建胞外可山东大学博士学位论文连续降解木素的氧化还原体系的探索，取得了初步结果。本研究丰富了人们对白腐菌胞外低分子系统在组成、功能等方面的认识，并在检测方法和木素降解研究思路上做了积极的探索。本论文的主要研究结果如下：一、从旦chrysosprium胞外培养液中分离到三种新型低分子量组分，它们的结构、性质各具特色，根据来源或性质，分别命名为Pcfactor、Pcreducer和MnPpromoter1、具有类似漆酶活性的

6、低分子量组分Pcfactor从Pchrysosprium的培养液中分离到一个新的具有酚氧化活性的低分子量组分，命名为Pcfactor(Pc因子)。Pcfactor能够直接氧化酚型木素模型物，如2,6．二甲氧基酚(2,6-dimethoxyphenol，2,6-DMP)，2，2’-连氮二(3一乙基苯并噻唑-6-磺酸)f2,2’-azinobis(3．ethylbenzathiazoline．6．sulfinicacid)，ABTS)和丁香醛连氮等，不需要Mn2+和n202的参与。Pcfactor与2,6．DMP反应

7、的动力学特点如图1所示：。。’’。‘。。’experimenta。data‘。。。。。。——fittingcurvebySigmoidadOes—resDOnsesquation(variableslope)，R2-099．top=0375．HiIIslope=027Time(sec)Fig．1Reactionprocessof2，6-DMPoxidizedbyPcfactorandtitlingdatabysigmoidalequationPcfactor与2,6．DMP反应的动力学符合S型曲线模式，反应速率上

8、升很快，可迅速到达饱合值，适合用Sigmoidaldoes-response(variableslope)方程y=Bottom+石{篝妄‰拟合。这与MnP和2,6-Dm的反应动力学特点明显不同(MnP的v．r曲线为线性，符合一级反应动力学模式)。这一动力学特点表明在没有新的电子供体和受体存在的条件下，Pcfactor氧化能力不能持续进行，表现为一个电子传递体的特征。该物质