杂色曲霉素对小鼠免疫细胞的细胞因子影响的实验的研究

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2、已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。黜躲猡缎翩躲僻+D》年乡月歹口日中文摘要杂色曲霉素对小鼠免疫细胞的细胞因子影响的实验研究摘要目的：杂色曲霉素(sterigmatocystin，ST)是致癌性的真菌毒素，是杂色曲霉(Aspergillusversicolor)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)等真菌产生的毒性代谢产物。在粮食和饲料中的污染非常普遍，甚至在潮湿居所的地毯灰尘中也可检出杂色曲霉素的污染。研究表明，在我国食管癌高发区居民饮食中ST也是主要污染霉菌毒素之一。众所周知，恶性

3、肿瘤的发生除致癌物的直接作用外，机体的免疫状态也发挥着非常重要的作用。近年来，一些真菌毒素对人或动物的免疫机能，特别是对细胞因子分泌和表达的影响引起了学术界的关注。由于细胞因子在免疫细胞间充当信号联络作用；是免疫细胞在功能上相互联络的"语言¨之一。通过这种”语言"，整个免疫系统才能协调一致。因此，研究外周血单个核细胞及腹腔巨噬细胞所产生的细胞因子的作用是揭示免疫应答本质的一种重要手段。目前国内外有关ST的研究多侧重于产毒的分子机制、污染现状和致癌性研究方面，而有关ST对机体免疫机能影响的研究较少。本研究组既往对ST的免疫调节作用进行了一系列的研

4、究，研究结果表明ST可以抑制体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞IL．12的表达与分泌；可以诱导或抑制小鼠脾细胞IL．2、IFN．Y和IL．4的表达与分泌；并且ST还可以对体外培养的人外周血单个核细胞(humanperipheralblood中文摘要mononuclearcells，HPBMc)培养上清中IL一2的分泌有一定抑制作用，提示ST对机体的免疫功能具有一定的影响。但是，上述研究均为体外分离培养免疫细胞进行的研究，从动物整体水平上的研究尚很少。因此，本研究采用半定量RT-PCR方法探讨了腹腔注射ST对小鼠外周血单个核细胞和小鼠腹腔巨噬细胞的TNF

5、．cc、IL．6和IL．12在mRNA水平的影响，并用ELISA方法研究ST对小鼠血清中TNF．c【及IL．6含量的影响，旨在从免疫角度探讨我国食管癌高发区粮食中常见优势污染霉菌毒素--ST对机体免疫系统的可能影响，揭示ST的暴露在我国食管癌高发区肿瘤发生发展中的可能作用。方法：1实验分组及动物处理选用健康雄性BALB／c小鼠96只，随机分为3组，分别为ST处理组、溶剂对照组和对照组。按照处死时间的不同，又将上述各组分为2h、6h、12h和24h四组。各ST处理组小鼠均经腹腔单次注射ST3000ug／kg，溶剂对照组和对照组动物分别腹腔注射同等

6、容量的溶剂(DMSO生理盐水溶液)和生理盐水。2小鼠外周血单个核细胞的分离小鼠摘眼球取血，用3．2％柠檬酸三钠(Na3C8H507．2H20)抗凝，采用聚蔗糖一泛影葡胺密度梯度离心法分离小鼠外周血单个核细胞。3小鼠血清的制备小鼠摘眼球取血，待血凝固后离心取上清，．80℃保存备用。4小鼠腹腔巨噬细胞的分离中文摘要将小鼠眼球放血处死后，浸泡于75％酒精，用10m1冰冷的无血清RPMI一1640培养液冲洗腹腔，无菌收集腹腔渗出细胞。计数细胞后，按5x106cells／mL接种于含105U／L青霉素、100mg／L链霉素的RPMI．1640培养液中，3

7、7℃、5％C02培养2小时以使巨噬细胞贴壁。5细胞总RNA的提取、鉴定及定量采用异硫氰酸胍～步法提取细胞总RNA。1％琼脂糖电泳鉴定其完整性。紫外分光光度计进行定量。6RT-PCR检测细胞因子mRNA的表达检测ST在不同处理时间对小鼠外周血单个核细胞及腹腔巨噬细胞TNF．Q、IL一6和IL．12mRNA表达的影响。采用凝胶分析软件(BIO．LD)对凝胶进行定量，各组以目的基因与内参照基因GAPDH量的比值表示目的基因相对表达量。7ELISA检测血清中细胞因子的水平采用晶美生物工程(北京)有限公司的小鼠TNF．0【、IL．6定量试剂盒，检测ST处

8、理不同时间对小鼠外周血中TNF．0【和IL．6水平的影响。8统计采用SPSSl2．0软件进行相关分析与单因素方差分析(analysisofvarian