小鼠胸腺t细胞淋巴瘤模型的改进及治疗的初步研究

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1、福建医科大学硕士学位论文小鼠胸腺T细胞淋巴瘤模型的改进及治疗的初步研究姓名：范双翼申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：余英豪20090301福建医科大学2009届硕士研究生学位论文小鼠胸腺T细胞淋巴瘤模型的改进及治疗的初步研究摘要【目的】本课题旨在通过调整给药方案和实验周期，进一步提高N．甲基．N．亚硝基脲(MNI7)诱导小鼠胸腺淋巴瘤模型的成瘤率并降低死亡率；利用此种动物模型，采用原代培养方法，以期建立一个新的淋巴瘤细胞系／株；以小鼠T淋巴瘤细胞株EL．4细胞株为模型，研究淫羊藿素(ICT)是否抑制其增殖，并就其作用机制

2、做初步探讨；研究ICT是否抑制州U诱导小鼠胸腺T细胞淋巴瘤的裸鼠移植瘤的增殖。【方法】1．第一部分，选用6"--'8周龄C57BL／6小鼠80只，随机分实验组66只，对照组14只。根据体重于第1周腹腔内注射MNU诱导液，分为3个剂量组(G1、G2、G3)，剂量分别为50、50、100mg／kg体重；对照组(GO)14只，经腹腔内注射等量生理盐水(50mg／kg体重)。第5周，G1、G2实验组第2次经腹腔内注射MNU诱导液，剂量分别为50、70mg／kg体重；对照组(G0)与G3实验组经腹腔内注射等量生理盐水(50mg／kg体重)。注射后观

3、察动物一般情况，对濒死及死亡小鼠进行解剖观察。第25周采用颈椎脱位法处死全部小鼠，解剖检查胸腺淋巴瘤的发生及其他脏器情况。应用光镜和免疫组织化学方法(所选抗体有CD3、CD20、TdT及PCNA)，对诱发的胸腺淋巴瘤及其侵袭脏器进行研究并鉴定肿瘤细胞来源、分型。2．第二部分，在第一部分诱导的胸腺淋巴瘤模型基础上，采用胰蛋白酶消化法、机械分散法获取肿瘤细胞混悬液，进行肿瘤细胞原代培养。3．第三部分，研究ICT体外对EL-4细胞作用及机制：应用MTT比色法检i贝UICT对EL-4细胞增殖能力的影响；应用透射电镜技术、流式细胞术检测ICT对EL

4、-4细胞凋亡的诱导作用；用RT—PCR技术检测ICT作用后EL-4细胞2福建医科大学2009届硕士研究生学位论文Bcl．2、P21基因mRNA表达水平的改变；通过比色法检测ICT作用后对EL．4细胞Caspase．3、Caspase．9酶活性的影响。4．第四部分，建立MNU诱导小鼠胸腺T细胞淋巴瘤的裸鼠异种移植瘤模型，研究ICT对移植瘤的作用。设生理盐水阴性对照组，环磷酰胺阳性对照组及ICT高、中、低三个浓度组，每组5只裸鼠。高、中、低浓度组分别按每只每次腹腔注射ICT0．5mg／kg、1．0mg／kg、1．5mg／kg进行给药，阴性对照

5、组注射等量生理盐水，每天给药一次，连续10天。阳性对照组每只每次腹腔注射10mg／ml，0．2ml(共2mg)环磷酰胺，隔天给药一次，共3次。末次给药后24小时，处死裸鼠。称量离体瘤块重量、计算抑瘤率，对瘤组织及心、肝、脾、肺、肾等组织进行病理学检查，检测ICT对裸鼠异种移植瘤生长的影响。【结果】1．第25周，83．3％(55／66)实验组小鼠产生胸腺淋巴瘤；包括5只死亡小鼠，死亡率7．6％。55例胸腺肿瘤光镜下主要表现为：胸腺结构破坏，代之以弥漫分布的中等大小淋巴样细胞，细胞形态一致，胞质稀少，核圆形、卵圆形，染色质细腻，核仁显著，核分

6、裂象多见，可见“星空’’现象。免疫组化显示瘤细胞表达CD3和TdT。2．采用胰蛋白酶消化法、机械分散法获取肿瘤细胞混悬液。接种48h后活细胞率由98％±1．5％降低为30％±3％，无法传代及继续培养。3．ICT对EL-4细胞的增殖具有明显的抑制作用：MTT比色法试验显示ICT能明显抑制EL-4细胞增殖，且随着药物浓度的升高、作用时间的延长该抑制作用明显增强，呈量效及时效关系。透射电镜及流式细胞术结果显示，ICT可诱导EL-4细胞凋亡。RT-PCR显示，以40“mol／L的ICT处理EL一4细胞6h后，bcl一2、P21基因的mRNA表达下

7、调。比色法Caspase．3、Caspase-9酶活性检测显示40、809mol／LICT作用6h能够显著增强EL．4细胞Caspase．3酶活性，也可同时增强Caspase．9酶活性。4．ICT作用前后，虽然裸鼠移植瘤大小等无明显差异，但在光镜下可观察到ICT中、高剂量组(1．0mg／kg、1．5mg／kg)中均有1例出现明显增多的固缩细胞及较多核碎屑。【结论】福建医科大学2009届硕士研究生学位论文1．通过调整给药方案和实验周期后腹腔注射MNU，可诱导小鼠产生胸腺T细胞淋巴瘤，成瘤率较之前67．5％提高为83．3％，死亡率较之前10％

8、降低为7．6％。2．体外原代培养C57BL／6小鼠胸腺T细胞淋巴瘤肿瘤细胞未获成功，培养条件及方法尚待摸索。3．ICT可抑制体外培养的小鼠T淋巴瘤EL．4细胞的增殖并诱导其凋亡，可能系通过下调