环氧合酶-2和血管内皮生长因子在人牙髓中的分布与表达

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1、前言牙髓是一种被牙体硬组织包绕的疏松结缔组织，受到细菌感染或理化刺激后会发生炎症反应。炎症组织中受损的细胞可以释放大量的炎症介质，引起血管扩张、通透性增加，趋化炎性细胞进入受损部位，参与炎症反应的发生和发展，造成牙髓的变性或坏死。牙髓炎中升高的炎症介质包括神经肽、5一羟色胺、组胺、前列腺索、缓激肽、白三烯、补体成分和各种细胞因子等，他们在牙髓的病理过程中具有重要意义。环氧合酶(Cyclooxygenase，COX)是以花生四烯酸(ArachidonicAcid，AA)为底物合成前列腺素(Prostaglandins，PGs)的关键酶和首要限速酶，已证实存在两种亚型：C

2、OX一1和COX-2。COX-1是一种结构酶，属”看家基因”，在大多数正常组织中稳定表达，是静止期细胞合成基础PGs的限速酶。它主要参与正常的生理功能，维持正常血管完整性uJ，炎症时它的表达水平无变化；COX-2则是诱导型酶，生理状态下，大多数组织不表达。当受到炎症性的细胞因子、生长因子、内毒素、及某些有丝分裂原的刺激时，COX-2的表达可以迅速升高怛。。研究发现∞J，COX-2的合成产物(如PGE二)与疼痛和炎症有关，通过增加血管通透性引起组织水肿，对炎症细胞有趋化作用，降低外周痛觉感受器的刺激阈值而致痛。在一些炎症组织中，COX-2表达水平与炎症严重度呈正相关H1

3、。可以认为COX-2通过催化病理性PGs合成，引起炎症的放大与增强。前列腺素是一种很重要的炎症介质。过量的PGs被认为与慢性炎症性疾病及炎性疼痛有关H‘6]。很多的研究都证实门“o，炎症牙髓中PGs的水平要高于正常牙髓。血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是一种有效的血管生长调节因子。其主要的生物学特性是，增加微血管的通透性，促进血管内皮细胞的增殖与移行，诱导血管新生。正常情况下，VEGF表达水平较低，在一些病理情况下，如炎症、肿瘤，可出现VEGF的过量表达，被认为参与炎症发展过程中的血管反应和肿瘤血管生长n⋯。

4、但对牙髓组织中COX．2和VEGF的表达与调节机制知之甚少。因此本实验中我们对人牙髓组织中cox．2和ⅦGF的表达和定位进行研究，有助于进一步了解牙髓组织炎症的发生和发展及组织破坏机理。·7·材料与方法一、实验器材：图像分析仪Metamorph，图像采集软件C-2．1W95E图像分析软件MetamorphImagingSystemv4．6(UIC，USA)显微照相系统Coolsnapfx(Roper，Japan)二、实验试剂：COX-2兔抗人多克隆抗体VEGF兔抗人多克隆抗体生物素化羊抗兔IgGSABC试剂盒，DAB显色试剂盒(以上均为武汉博士德公司产品)阴性对照：以

5、PBS缓冲液(PH=7．4)代替一抗4％多聚甲醛固定液三、实验取材、预备：选取16名临床患者(男女各半，年龄15—42岁)拔除的健康前磨牙和健康第三磨牙样本，要求牙齿元龋坏、隐裂、发育不全等硬组织缺损，患者无系统性疾病，近2月未曾服用免疫抑制剂和抗生素药物。拔除后，立即沿牙齿长轴用金刚砂车针和锤子纵剖开牙齿，用探针或挖匙取出25个健康牙髓样本，置于新鲜配置的4％多聚甲醛液中固定一周。从31名临床患者(男女各半，年龄15—42岁)的治疗牙齿中取出40个炎性牙髓组织样本，要求取自牙髓暴露的龋坏牙，患者有自发痛史、有冷热刺激引发的持续性疼痛，元明显叩痛，X光片检查未见根尖阴

6、影，临床诊断为慢性牙髓炎。开髓后能取出完整的牙髓，未见坏死和脓肿。患者无系统性疾病，近2月未曾服用免疫抑制剂和抗生索药物。用挖匙或拔髓针取出完整的炎性牙髓组织，固定于新鲜配置的4％多聚甲醛液一周。牙髓组织样本用梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋。每个牙髓标本做冠根向纵切5斗m厚连续切片，用于HE染色、COX-2和VEGF的免疫组化染色，阴性对照。四、HE染色：·8·切片常规脱蜡至水，苏木素lO分钟，水洗一次，盐酸酒精分化30秒，水洗反蓝30分钟，伊红染色3分钟，脱水，95％酒精3分钟，100％酒精I，Ⅱ各10分钟，二甲苯透明I，Ⅱ各10分钟，树胶封片。100倍、2

7、00倍、400倍光学显微镜下观察。五、免疫组化染色：(1)将石蜡切片在烤箱中预热60分，常规脱蜡至水(二甲苯I、Ⅱ液各10分，100％脱蜡酒精I，Ⅱ液各10分钟，98％脱蜡酒精5分钟，90％脱蜡酒精5分钟，80％脱蜡酒精5分钟)。放入新鲜配制3％双氧水，室温10分钟灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次。(2)热修复抗原：切片浸入0．01M枸橼酸盐缓冲液(PH6．0)，电炉加热至沸腾后断电，间隔5一lo分钟，反复2次，冷却后用磷酸缓冲液(PBS)洗2次。(3)滴加正常山羊血清封闭液，室温40分钟，甩去多余液不洗。(4)分别滴加稀释的COX一2或VEGF一