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1、蛋白纯化答疑By aqiao发表于2007-4-1518:38:00 凝胶过滤层析也叫做分子排阻层析。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。关键是不知道你用什么凝胶过滤层析。一般来说大部分细菌比蛋白质小，要看是什么的凝胶过滤层析，才能达到材料上的阻挡。响凝胶过滤层析的多种因素很多人以为凝胶过滤非常简单直接，无需花太多精神仔细优化。其实影响凝胶过滤的参数非常多，现与大家分享几点经验：1层析柱必须有柱头及分布器，即adaptor，紧压胶面完合没有空隙，否则样品上样受影响。2凝胶悬浮液不可太稠，否则很容易出气泡；太稀装柱时间
2、过长，亦影响效果。50-70%较适合。若是干粉，溶胀时间必须充足。装前完全搅匀。3一次性倒入层析柱中，容量不够则需加装柱器。切不可分几次倒，柱效和对称性都很难合格。4装柱及层析工作所用缓冲液的温度需一样。5柱底网下的气泡一定要除掉，可先用20%乙醇湿一下底网。6每种胶在不同柱高下的装柱流速、压力都不一样。跟足介质说明书的指引就万无一失了！找不到查AKTA系统的Unicorn中主屏幕的adviser即可，也可以查这光盘上有关层析凝胶的操作手册。7上样前柱平衡非常重要，不光UV平稳，至少平衡一个柱体积。8缓冲液pH值会影响分离效果，经验中用pH7.0和pH4.5
3、的缓冲液分离5个低分子量标准蛋白，结果颇有不同。9加入0.15MNaCl可防止非特异性的吸附及蛋白间的聚合。如果在适当期间加入不同的材料可以有效的防止对应的细菌。老兄，我新手哈，只能给你这么多的了。http://www.ebioe.com/bio101/2006/6872.htm这个网站可以稍微帮你点参考，但是得全综合来总结，我就不方便全部总结了！请多支持我哈，个人感觉你的问题太简单了。不好针对性的回答，不可能把所有的情况说出来再分析吧？~！回答者：janefeng1986-试用期一级3-2301:52同意楼上的说法回答者：菜刀狗狗-助理三级3-2518:2
4、5一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟
5、，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶
6、液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。这是标准配方:裂解液：50mMTris-HCl(pH8.5~9.0),2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用)但我个人的经验是:如果你裂解细菌是
7、为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘.protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体.如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了.但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间.沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先
8、用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是
