《疫组化知识》word版

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1、免疫组织化免疫组织化学        免疫组织化学(Immunohistochemistry)又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支,它是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)的分布进行组织和细胞原位检测技术。1.发展简史——1941年Coons首先用荧光素标记抗体—检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。——60年代Nakane建立酶标抗体技术——铁蛋白标记Ab技术。——70年代Stemberger改良上述技术,建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶(PAP)技术,使免疫细胞化学得到广泛应用。——80年代Hsu等建立了抗生物素—生素(ABC)法之后,免疫

2、金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。——90年代  分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。——2000年  各种免疫组化技术更加成熟,使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科,是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。2.免疫组织化学的技术分类(1)根据染色方式分成:①贴片染色;②漂浮染色。(2)根据Ag—Ab结合方式分成:①直接法;②间接法;③多层法。(3)按标记物的性质分成:①免疫荧光技术(免疫荧光法);②免疫酶技术(酶标抗体法、桥法、PAD法、ABC法);③免疫

3、金属技术(免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法)。3.标记物(1)必要性:组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不可见的,若在镜下检测,则必须具有可视性标记物。(2)常用标记物        ①  荧光素:最常用的是异硫一氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)——荧光显微镜下呈绿色荧光四乙基罗达明(rho—damineRB200)——荧光显微镜下发橙红色荧光;        ②  酶:辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。        ③  生物素:(Biotin)        ④  铁蛋白金等:主要应用于免疫电镜。       

4、其他:如同位素(因涉及污染和防护难一般不用)4.应用        凡是组织细胞内具有抗原性的物质,如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示,因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。最近几年,分子生物学研究异常活跃,但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位,进而深入研究其功能。 一、免疫组织化学技术(一)染色方法1.直接法       荧光素直接标记特异性抗体(—抗)上,标记抗体与抗原结合(在切片上)荧光显微镜下观察→检测抗原。 △  酶标抗体要显示后镜检。      直接法优点:简单,时间短

5、,特异性强。缺点:灵敏度低,所需抗体量大(不经济)。应用:基本不用了!!2.间接法        荧光素标记在二抗上(二抗:抗产生一抗动物的IgG抗体)。显色后镜检        特点:较直接法灵敏,可标记一种抗体→鉴定多种抗原。      3.非标记Ab桥法:       “桥法”是酶标记抗体的改进,经过三次抗体,其二抗为未标记桥抗体。(1)单桥法                (2)双桥法       在三抗之后,将二抗和三抗再重复一次,可增大染色强度。特别提示:注意动物种属关系4.PAP法(过氧化物酶—抗过氧化物酶法        Peroxidase

6、anti—peroxidasemethod,PAP法)~是桥法的改良,既先形成PAP复合物→抗原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物。         该法简化了操作步骤,提高了灵敏度,所染标本可长期保存。 5.ABC法(亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法,Avidin—biotin—peroxidaseComplex   method,ABC法)   Avidin:  亲和素,一种糖蛋白,其上有4个与生物素相结合的位点。   Biotin:生物素—维生素H,两者亲和力巨大,牢不可破。ABC法与PAP法的区别是:以ABC复合物代替PAP复合物。(1)ABC复合

7、物的制备:      (2)ABC法反应原理         6.SP或SAP法(过氧化物酶标记的链霉卵白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色)Streptavidin/peroxidaseorstrepta-vidin/alkalinephosphatase)        该法是ABC法基础上的进一步改良,使卵白素与链霉(而非生物素)结合,而后再结合PO。它有4个亚基可与生物素结合,灵敏特异,背景低,成本低。        现在还有plus盒。优点是:更简便,放大倍数↑,等电点中性更适合组织。分子量小,穿透力↑,原理保密。 7.蛋白A—金法(Protein

8、—Agoldmethod)      多用于电镜8.

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