《包被抗原合成》word版

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1、!）包被抗原合成。为了避免载体蛋白对抗原?抗体反应的干扰，必须用与免疫抗原载体蛋白不同的蛋白作包被抗原的载体。因此本试验选用鸡卵清蛋白（@A(）作为载体合成包被抗原（)*%!@A(），合成方法同)BSA。1971年Ercegovich等首次采用免疫分析技术对DDT、马拉硫磷以及氨基三唑这3种农药进行残鼹分析，放此舞创了免疫分橇技术在农业、环境领域应用的先河¨j。到2005年，世界上近300种农药中大约有70种以上已经建立了相应的免疫学分析方法珏】。经过几十年的飞速发震，农药免疫分析技零以其检测灵敏度高，样品前处理简单，样品需

2、求量少等优点，成为农药残留仪器检测方法的替代技术，可以有效地检测单种农药污染物旧。J。但是由予传统的免疫检测法遥求抗原一抗体识别的高度特异性，通常1种抗体只能检测单种农药(或其结构类似的代谢物)，难以满足实际检测时一次测定要求对多种农药间时检出的需求，不熊实现农药的多残懿免疫检测，限制了农药免疫分析的应用M嵋j。为了解决这一问题，需要针对每个靶标物制备不同的抗体，并把这些抗体整合使用在溺一个检测体系中。耨勇一个更加经济的实现途径怒制备一次试验可以同时检测多种靶标物的抗体——广谱特异性抗体(Broad—s矽e懑e诹懿￡ib藤i

3、es)‘引。本文将对农药广谱特异性抗体的制备方法，以及有机磷、拟除虫菊酯、氯基甲酸醣三大类农药的广谱特异性抗体制备及免疫多残留分析技术的研究现状进行综述。1广谱特异性抗体的制备方法通常建立一种农药的免疫分析技术需要考虑以下几个环节：靶标物、半抗原、免疫原、抗体的类型、特异性、检测形式和标记物¨0

4、。建立检测方法的第一步就是要明确检测的靶标物，如是单一物质的特异性检测，还是广谱的族特异性检测。而现代检测技术的发展趋势要求提高检测样品的通量和在一个试验中同时检出多种分析物。这就要求制备具有广谱特异性的抗体，它能与一类化合物相结合

5、，并被应用于广谱特异性的试验。目前广谱特异性抗体的制备，通常采用的途径一般分为3种：①选择一类农药的共性结构制备抗体；②制备抗独特型抗体；③重组抗体。1．1利用农药的共性结构作为半抗原制备抗体选择农药的共有结构作为半抗原是目前制备广谱特异性抗体最简便和使用最多的方法。对多种目标物化学结构进行分析寻找出共有结构，并结合分子模型技术辅助设计出共性结构半抗原，用于制备针对一类结构的广谱特异性抗体。由于农药等小分子物质通常都是分子量较小的物质(一般小于1000)，因此要肌体对该物质获得免疫应答，就需要将其与载体分子(通常是蛋白)连接

6、成为免疫原。在设计这些用于免疫原制备的半抗原的时候也必须考虑到连接位点交联在蛋白上时不会使其一些特征结构受到影响⋯叫引。混合酸酐法制备包被抗原¨’：称5．4嘲半抗原(约18ttm01)溶于200ttL无水DMF中，然后按顺序加入4．27ttL(约18ttm01)三正丁胺和2．34L(约18ttm01)氯甲酸异丁酯，室温下搅拌反应1h．将30IIlgOVA溶于2mL碳酸盐缓冲溶液中，搅拌下缓慢滴加100ttL上一步反应液，室温下搅拌反应3h，然后透析，离心，冷冻干燥，4℃保存．精确测量透析后溶液的体积，计算最终的P(BFNH—

7、BSA)为12ms／mE，p(BFNH—OVA)为8．0ms／mE，以最后一次的透析外液作空白，分别对BFNH溶液，BSA溶液，OVA溶液，BFNH—BSA溶液，BFNH—OVA溶液进行紫外扫描，根据扫描图谱确定是否发生了偶联，红外光谱仪进·步鉴定偶联物阻lo】．对透析结束后的样品冷冻(4℃)干燥，上清液冷冻保存．估算半抗原与载体蛋白结合的结合比的公式：结合比=(E"2110(B嗍一略^)一E：280BSA)，e瑚B州H(e=Abc．其中，A为吸光值；b为比色杯直径；c为样品摩尔浓度)．1．2．4抗血清效价测定设置包被抗原质

8、量浓度梯度为4，2，1，0．5，0．25和0．125弘g／rIIL，方阵试验选择抗原抗体最适工作浓度，采用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定效价¨“12]．具体步骤如下：1．2．4．1包被将稀释好的包被抗体加入ELISA板，100弘L，孔，4℃放置48h．1．2．4．2封闭洗涤液冲洗ELISA板3次，加封闭液，200“U孔，37oC，1h．1．2．4．3待检样本洗板3次，加入梯度稀释的待测血清样品和阴性对照，100“L，孔，37℃，1h．1．2．4．4加酶标抗体洗板3次，加入准确稀释的酶标抗体，100肛U孔，37℃，1

9、h．1．2．4．5加底物显色洗板3次，加入底物TMB，100pu孔，室温或37℃显色15—30min．1．2．4．6酶标仪测定A。砷值在A伽值为1．0左右，抗体抗原用量较少，即为抗体抗原的工作浓度．在效价测定时，若待测孔A．∞值大于或等于阴性对照的2．1倍，即为阳性效价．1．2．6制作呋喃