现代生物技术在病原微生物检测中的应用研究

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1、现代生物技术在病原微生物检测中的应用研究陈兰芳胡蓉严小梦湖南省津市市人民医院检验科415400【摘要】病原微牛物的分型检测在临床感染性疾病的诊断中发挥着重要作用。随着人类基因组计划的完成，分子牛物学技术为病原微牛物的分型检测提供了更多的分子靶点，进一步促进了病原微生物分型技术的发展，逐步取代了传统的分型方法。木文就近年来分子生物学技术应用于病原微生物分子分型的研究进行了综述。【关键词】病原；微牛物学；分子牛物学；分子分型病原微牛物引起的感染性疾病，如不及时治疗常可危及患者的牛命。对病原微牛物进行准确分型是探讨其致病性、流行性、变异性以及耐药性等

2、特征的关键。因此，长期以来，学者们在积极寻找快速、准确、灵敏度高、特异性强的病原微牛物分型方法。随着分子牛物学技术的迅速发展，分子生物学技术应用于病原微牛物分子分型成为临床诊断研究中的热点［1］。一、传统的病原微牛物分型方法传统的病原微牛物分型主要依据其培养特性和牛化特征，常见的分型方法有血清型、噬菌体型和抗菌药物耐受谱型等。其中，血清学分型是依据细菌的菌体抗原（0抗原）、鞭毛抗原（H抗原）以及荚膜抗原（K抗原）对其进行分型的。1938年，Graigie采用噬菌体对伤寒沙门氏菌进行分型，并被广泛应用于细菌的流行病学鉴定与分型。抗菌药物耐受分型通

3、常采用微量稀释肉汤法、纸片法等测定分离菌株的耐药谱加以分型。上述分型技术在临床上应用广泛，具有十分重要的作用，但分辩力较弱，重复性较差，标准化较难。二、现代病原微生物的分子分型方法近年来，随着分子牛物学技术快速发展，新的诊断技术和方法不断涌现并广泛应用于临床微牛物的检测，为病原微牛物的致病性、流行性、变异性以及耐药性分析等方面提供了重要的信息。目前，应用分子生物学技术对病原微生物进行分型的方法包括：脉冲场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)分型、聚合酶链反应(polymerasechainreact

4、ion,PCR)分型、生物芯片分型、多位点序列分型(multilocussequencetyping,MLST)＞质粒DNA图谱分型以及限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)分型等。2丄脉冲场凝胶电泳分型PFGE技术以其重复性好、分辨力强而被誉为细菌分子分型的“金标准”。它可以用于大分子dna的分离，其分辨范围达到10Mb,而普通琼脂糖凝胶电泳仅能分离小于500Kb的DNAoPFGE的基本原理是通过电场的不断改变，使包埋在凝胶中的DNA分子的泳动方向发生改变，小分子DNA比大

5、分子DNA泳动快，从而在凝胶上按DNA分子大小呈现出特异的电泳图谱。病原微生物的基因组DNA经脉冲场凝胶电泳，使大片段DNA有效分离。DNA条带的密度反映了病原微生物基因组DNA的含量以及分子的大小，最终达到分型的目的。目前，PFGE已被广泛的应用于病原微生物的分型，Swaminathan等⑵已经建立了针对大肠杆菌0157：H7^沙门菌属的Typhimurium血清型、李斯特菌、志贺菌属等病原微生物分型的标准PFGE操作方法。有研究认为PFGE的分辨力强于核糖体分型和随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDN

6、A,RAPD)分型。当采用「个限制性核酸内切酶的分辨力不强时，可以采用2种限制性核酸内切酶加以提高。当然，PFGE也有一些局限，如耗吋长、成本高等。另外，电泳图谱易受操作人员技术水平等因素的影响，这为不同实验室间的比较带来一定困难［3］。2.2.聚合酶链反应分型PCR技术自1985年发明以来，以其灵敏度高和特异性强受到了人们的高度重视，成为核酸扩增和检测的一种常规方法⑷。用于病原微生物分子分型的PCR方法主要有RAPD分型和重复序列PCR分型2种。RAPD是建立在PCR基础上的1种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子生物学方法。该方法以

7、基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核昔酸序列(通常为10个碱基)为引物，在热稳定的DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳后，对其进行多态性分析,反应不同基因组DNA特点，从而对病原微生物进行分型。RAPD可以在物种没有任何基因组信息的情况下分析其DNA多态性，对模板DNA的纯度要求不高，无需DNA探针和分子杂交。重复序列PCR分型是Versalovic于1996年描述的1种细菌基因组指纹分析方法，即PCR扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，经电泳图谱比较分析揭示基因组间的差异。研究表明重复序列PCR

8、分型与RAPD分型有相同的分辨力，但操作相对复杂。然而，重复序列PCR分型的再现性非常好，这是RAPD无法比拟的。此外，多重PCR、巢式PCR等也可用