《饲料中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测 EMA-PCR法》.doc

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1、《饲料中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测EMA-PCR法》河南省地方标准编制说明一、编制的目的和意义单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）简称单增李斯特菌，是危害公共卫生和食品行业的一种重要人畜共患致病菌，主要存在于肉类、乳制品和蔬菜中，可引起脑膜炎、败血症和流产，特别对孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人危害严重。自1961年，英国首次报道2例由单增李斯特菌引起的脑膜炎病例以来，相继在美国、加拿大、比利时等国家报道了新生儿单增李斯特菌感染事件。1985年美国有52人死于食用受单增李斯特菌感染的软干酪。201

2、1年美国18个州72人因食用受李斯特菌污染的甜瓜而染病。在我国感染性腹泻致病菌中李斯特菌居首位。因此，建立快速、特异、灵敏的检测标准对于单增李斯特菌早期预防及疫情的有效控制至关重要。我国目前主要采用传统培养方法进行单增李斯特菌的检测，需要一周时间左右，费时费力。本次研究以单增李斯特菌溶血素蛋白的基因Hly序列为靶基因设计一对引物，采用EMA与PCR相结合的方法进行检测，能够有效地区分单增李斯特菌的死菌与活菌，避免了因死菌DNA存在造成的假阳性结果，同时减去了传统培养方法中目标菌分离纯化的步骤，节约了大量检测时间。本次研究结果显示，PCR

3、检测单增李斯特菌的灵敏度在1.0×102cfu/mL左右，从预增菌、样品处理、PCR扩增、凝胶电泳只需要2d左右，与传统培养学方法相比，稳定性好、灵敏度高、特异性强，可用于检测饲料中单增李斯特菌的污染状况，对饲料的安全监测具有重大意义。一、任务来源及编制原则和依据1、任务来源根据河南省质量技术监督局文件《河南省质量技术监督局关于下达2017年第一批河南省地方标准制修订计划的通知》（豫质监标发〔2017〕104号）的要求，由河南省兽药饲料监察所负责对河南省地方标准《饲料中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测EMA-PCR法》（立项编号：201

4、71210481）的起草、制定工作。2、编制原则符合国家法律、法规和政策，本着严格遵循科学依据，与国际水平接轨，并且准确、实用、快速的原则，开展了本次研究工作。3、编制依据主要依据以下标准：NY/T1902饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验，GB4789.30食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB19489实验室生物安全通用要求，GB4789.28食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求。三、编制过程标准的编制过程分三个阶段进行：第一阶段：单核细胞增生李斯特氏菌活菌EMA-PCR检测方法的建立1.引物设计根据单核细胞增生李

5、斯特氏菌单核细胞增生李斯特氏菌Hly基因序列设计一对特异性引物。根据该基因中的保守且特异性序列，设计扩增271bp大小的特异性引物对。表1引物序列引物序列片段大小上游5'-GATGACGAAATGGCTTACAGTGAAT-3'271bp下游5'-CCACACTTGAGATATATGCAGGAGG-3'2.EMA-PCR方法参数的优化首先是探索单核细胞增生李斯特氏菌培养物的最佳致死方法和EMA最佳终浓度，分别采用煮沸裂解、紫外照射及化学方法对培养物进行处理，再分别加入EMA，制备成EMA终浓度成梯度变化的菌悬液，采用卤素灯进行光照交联。

6、然后通过离心收集上清液，进行PCR扩增，观察凝胶电泳结果，选出最优的致死方法和最佳EMA添加终浓度。其次是最佳曝光时间的确定，在上述试验的结果上，选出最优组合，采用卤素灯下分别照射0、1、2、4、6、8、10min，离心收集上清液，进行PCR扩增。1.确定方法的灵敏度和特异性。4.用建立的单核细胞增生李斯特氏菌EMA-PCR方法检测饲料及饲料原料样品，并与NY/T1902-2010饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验比对，以验证该方法的实用性和准确性。第二阶段：单核细胞增生李斯特氏菌EMA-PCR检测方法应用实验本阶段主要进行单核

7、细胞增生李斯特氏菌EMA-PCR检测方法在河南省范围内的应用实验。为了进一步验证所建立的诊断方法的特异性、敏感性和实用性，由河南省兽药饲料监察所进行饲料样品检测应用试验。共对来自全国4个省（大部分样品来自河南省）共计216批饲料及饲料原料样品进行了应用检测；共检测出1批单核细胞增生李斯特氏菌阳性样品，并对单核细胞增生李斯特氏菌进行了分离鉴定。同时与NY/T1902-2010《饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验》进行了对比，检测结果显示，EMA-PCR方法检测结果与传统培养法NY/T1902-2010检测结果完全一致，但检测时间比

8、传统培养法缩短了2-3天的时间。通过对比发现，EMA-PCR方法具有准确、快速的特点，在应用推广方面具有一定的优势。第三阶段：标准的起草、修改与制定根据以上实验资料及所有参与实验人员意见，在系统统计、科学分