腺病毒载体在肿瘤治疗中的应

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1、优秀精品课件文档资料2条件增殖腺病毒在肿瘤治疗中的策略条件增殖腺病毒在肿瘤治疗中的策略微生物教研室　李晓霞3内　容基因治疗分类主要病毒载体系统腺病毒载体在肿瘤治疗中的策略条件增殖腺病毒现状及策略基因治疗及分类5Gene-targetedtherapy，以基因为靶点的治疗，将遗传物质导入人体组织或细胞所进行的疾病的治疗基因治疗6历史与回顾1980年有人提出用磷酸钙介导基因转移来治疗地中海贫血。离体基因治疗exvivo80年代初建立逆转录病毒体系为基因治疗提供高效率的转移载体。1989年5月22日R

2、osenberg首次将外源基因-新霉素抗性基因用逆转录病毒导入肿瘤浸润淋巴细胞中。7历史与回顾Anderson于1990年9月4日第一次用于人类疾病的基因治疗，两例由于腺苷脱氨酶缺失导致的免疫缺陷的女孩经逆转录病毒载体将该酶基因导入骨髓而获救，并且存活至今。2004年1月，深圳赛百诺基因技术有限公司将世界上第一个基因治疗产品重组人p53抗癌注射液(商品名：今又生)正式推向市场，这是全球基因治疗产业化发展的里程碑8基因治疗分类根据给药途径和方法离体基因治疗exvivo原位基因治疗insitu体内基因治

3、疗invivo9基因治疗分类离体基因治疗exvivo—将目的基因在体外导入自体或异体来源的肿瘤细胞或其它细胞，再将这些修饰过的靶细胞转入体内。原位基因治疗insitu—将目的基因载体直接注射或导入体内的肿瘤组织，进行局部治疗，这也是最主要的方法。体内基因治疗invivo—将目的基因载体注射到血液系统进行全身治疗。10基因治疗分类根据基因导入的方法裸露DNA直接注射－注射genegun脂质体共转化－体外细胞转化受体介导的基因导入－病毒载体主要病毒载体系统12常用的病毒载体的特点13因该病毒最初来自腺体

4、，故命名为腺病毒(Adenovirus)。根据宿主可分鸟腺病毒属和哺乳类腺病毒。目前，把人腺病毒的46个血清型分为A-F6个组：A-E组：各型病毒均能在人的组织细胞(如肾细胞)常规培养中增殖，称为普通腺病毒；F组（40和41型）：是从粪便中发现，用常规细胞培养不能增殖的腺病毒，称为肠道腺病毒。腺病毒14基因治疗中常用的基因载体C亚群:2型及5型腺病毒增殖能力非常强，滴度通常可以达到109pfu遗传背景和生化结构清楚腺病毒球形，无包膜，直径70-80nm。二十面体病毒壳体17腺病毒壳体含有三种主要的蛋

5、白：六邻体（II），五邻体基底（III）和纤突（IV），还有多种其他的辅助蛋白VI，VIII，IX，IIIa和Iva2六邻体五邻体基质纤突蛋白18纤突结构域－CAR(coxsackieadenovirusreceptor)五邻体基质中精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸基序（Arg-Gly-Asp,RGD）－细胞ｖ整合素19腺病毒线性双链DNA,基因组36kb早期和后期转录单元前者有E1a、E1b、E2、E3、E4和两个延迟型早期单元Ⅸ和Ⅳa2，编码病毒的调节蛋白后者有L1、L2、L3、L4、L5五个区，编

6、码病毒的结构蛋白20腺病毒载体构建在人腺病毒C亚群的Ad2和Ad5基础上构建E1区为病毒复制必需区，缺失则成为复制缺陷型载体E3区是病毒复制非必需区，用于外源基因的插入21腺病毒载体的优点①腺病毒粒子相对稳定,病毒基因组重排频率低,外源基因片段插入片段在病毒复制几个周期后仍可保持不变,易于用重组DNA技术操作;②安全性较好,腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中,目的基因在宿主细胞基因组外游离状态下表达,整合突变致癌可能性小,基因毒性低;③腺病毒基因组较大(36kb),绝大多数基因组(约35kb)均能被外

7、源基因取代,插入大片段外源性基因的潜力大;④有较大的宿主范围,可以感染肝细胞、血管内皮细胞等多种人体细胞,对于受体细胞是否处于分裂期要求不严格;⑤腺病毒载体容易将外源基因直接转移到靶细胞中,并有效表达成活性蛋白。22第一代腺病毒载体去除了El/E3基因表达盒,可以插入长达615kb的外源DNA。去除E1区还阻止了依赖E1区和E2区功能蛋白的转录与随后病毒DNA的复制及病毒外壳蛋白的产生。E1区缺失的腺病毒在能够反式提供E1区基因蛋白的细胞中得到增殖。23第二代腺病毒载体在E1、E3缺失的基础上进一步

8、去除了E2区和(或)E4区,减弱病毒蛋白的表达用于鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症的I期临床实验。24第三代腺病毒载体通过对无感染能力的腺病毒颗粒的观察,发现无感染能力腺病毒颗粒的基因组都含有腺病毒基因组左端的一段序列即包装信号。因此设想保留两端TR(TerminalRepeats)及包装信号共约500bp的顺式作用元件,去除腺病毒基因组中全部编码序列(反式作用元件),其它功能由辅助病毒提供,这样的腺病毒载体就是第三代腺病毒载体即所谓空壳载体（gutlessadenovir